高效液相色谱测定依达拉奉中苯肼残留方法的优化.docx

Central South Pharmacy. August 2014, Vol. 12 No. 8 中南药学 2014 年 8 月 第 12 卷 第 8 期高效液相色谱测定依达拉奉中苯肼残留方法的优化李帅 1，廖彬 2*（1. 湖南省食品药品检验研究院，长沙 410001；2. 湖南药用辅料检验检测中心，长沙 410014）摘 要：目的优化 HPLC 测定依达拉奉中苯肼残留的方 法。 方法采用 HPLC 法， 以 Inertsil C18（150 mm4.6 mm，5 m）为色谱柱，以 0.05 mol L 1 磷酸二氢铵溶液（用磷酸调 pH 至 3.5）- 甲醇（65 ：35） 为流动相，流速为 1.0 mL min 1，柱温 30 ，检测波长为 226 nm，进样量为 20 L，以 0.05 mol L 1 磷 酸二氢铵溶液 - 甲醇（65 ：35）（用磷酸调 pH 至 2.0）作为溶剂。结果 苯肼在 0.17 0.68 g mL 1 与 峰面积线性关系良好（r 0.999 9，n 6），平均回收率 95%（n 3），苯肼溶液在 12 h 内稳定，最低 检测限为 0.34 ng。结论 本测定方法可靠、简便、结果准确、稳定性好，适于该制剂中苯肼残留的测定。 关键词：苯肼；高效液相色谱法；依达拉奉中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1672-2981(2014)08-0814-03 doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2014.08.027Optimization of HPLC determination of phenylhydrazine residues in edaravoneLI Shuai1, LIAO Bin2* (1. Hunan Institute for Food and Drug Control, Changsha 410001; 2. Hunan Pharmaceutical Excipients Testing and Inspection Center, Changsha 410014)Abstract: Objective To establish an HPLC method to determine phenylhydrazine residues in edaravone. MethodsThe ingredient was separated on an Inertsil C18 (150 mm4.6 mm, 5 m) column. The mobile phase was 0.05 mol L 1 ammonium acetate (adjusted pH to 3.5 by phosphoric acid)-methanol (65 ：35). The flow rate was 1.0 mL min 1. The column temperature was maintained at 30 , the detection wavelength was 226 nm, the injection vol- ume was 20 L. Ammonium acetate (0.05 mol L 1)-methanol (65 ：35) (adjusted pH to 2.0 by phosphoric acid) was used as the solvent. Results The linearity of phenylhydrazine was at 0.17 0.68 g mL 1 (r 0.999 9, n 6), the average recovery was more than 95% (n 3), the test solution was stable in 12 h, and the detection limit was 0.34 ng. Conclusion This method is simple, reliable, accurate, stable, and is suitable for the determination of phenylhydrazine residues in edaravone.Key words: phenylhydrazine; HPLC; edaravone苯肼是一种有机剧毒品，可致溶血性贫血，并可对 肝脏造成严重损害 1-2。苯肼是合成依达拉奉所必需的原 料 3-4，若生产过程中出现疏漏可能导致苯肼的残留。由 于依达拉奉一般制成注射液供临床使用，苯肼的残留可能 造成严重不良反应，因此有必要对其进行严格的控制。目 前测定残留苯肼的报道主要有阻抑动力学荧光分析法 5、 气相色谱法 6-7 与 HPLC 法 8 3 种。经笔者考察发现荧光 分析法操作繁琐、专属性差；气相色谱法灵敏度低，重 现性差；而文献报道中 HPLC 虽专属性较高、操作简便， 但溶液稳定性差，对照品溶液在 1 h 内降解 17.1%。故目 前 3 种测定方法均不能完全满足残留量苯肼的测定，因 此笔者对残留量苯肼的测定方法进行了摸索与改进，建 立稳定可行的方法。1 仪器与试药1.1 仪器LC20AT 高效液相色谱仪、LC-Solution 色谱工作站、 UV2550 紫外分光光度仪（日本岛津）；XP205 电子分析 天平（瑞士梅特勒公司，精度：0.01 mg）。1.2 试药苯肼（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20101126； 纯度 98%）；磷酸二氢铵、磷酸为分析纯试剂；甲醇 为色谱纯；水为去离子水；依达拉奉（湖南五洲通药业 有限公司，批号：121009、121012、121015，纯度均 99.0%）。2 溶液稳定性考察苯肼为还原性物质，接触空气或氧化物后易氧化分 解为酚类、醌类及苯胺等物质；同时苯肼水溶液显弱碱性， 遇酸生成相应盐类。故从苯肼化学性质入手，考察其在 不同溶剂、添加抗氧剂、不同 pH 等环境下的稳定性，优 选适宜的溶剂。2.1 苯肼在不同溶剂中的稳定性取苯肼，分别用水 - 甲醇（65 ：35）与纯甲醇溶解 稀释制成 4 g mL 1 的溶液，立即置紫外分光光度仪中 并分别在最大吸收波长处 226 与 233 nm 的测定。结果苯肼在 2 种溶液中吸光度在 1 h 内分别从 0.298 2 与 0.315 0降至 0.159 2 与 0.261 0，各降解了 46.6% 与 17.1%（见图作者简介：李帅，男，主管药师，主要从事药物分析与研究工作，Tel：（0731）82275861。 * 通讯作者：廖彬，女，主管药师，主要 从事药物与药用辅料分析工作，Tel：（0731）89919748。814中南药学 2014 年 8 月 第 12 卷 第 8 期 Central South Pharmacy. August 2014, Vol. 12 No. 8吸光度1）。结果表明苯肼在水与甲醇混合溶液及文献报道 8 采 用的纯甲醇溶剂中均不稳定。0.4BA0.4A0.40.40.30.3吸光度B0.20.20.1吸光度吸光度0.30.30t/s0.10t/s0.20.20.10.101000200036000100020003600图 3 苯肼在 pH 11（A）和 pH 2（B）水 - 甲醇溶液（65 ：0t/s 0t/s35）中的稳定性01000200036000100020003600图 1 苯肼在水 - 甲醇（65 ：35）溶液（A）和甲醇（B）中的稳定性 Fig 1 Stability of phenylhydrazine in water-methanol（65 ：35）（A） and methanol（B）2.2 苯肼在添加抗氧剂溶液中的稳定性苯肼合成步骤大致可分为重氮化、还原、水解、中 和与蒸馏 5 个步骤，其中还原步骤主要采用亚硫酸氢钠 作为还原剂。故取亚硫酸氢钠作为还原抗氧剂，取苯肼，Fig 3 Stability of phenylhydrazine in pH 11（A）and pH 2（B） water-methanol（65 ：35）solutionA21B21t/mint/min用水 - 甲醇（65 ：35）溶解并稀释制成含 0.2% 亚硫酸氢02.557.51002.557.510钠 8 g mL 1 的苯肼溶液，立即置紫外分光光度仪测定。 由于亚硫酸氢钠溶液具有较强的末端吸收，对测定有干 扰，故选择苯肼在第二吸收峰 273 nm 处进行测定。结果 吸光度在 3 h 内呈上升下降上升的趋势（见图 2）， 提高亚硫酸氢钠浓度至 0.5%，结果基本相同，表明抗氧 剂的加入不能提高苯肼稳定性。吸光度0.40.30.20.10t/s0500010800图 2 苯肼在水 - 甲醇（65 ：35）（含 0.2% 亚硫酸钠）溶液中的稳定性Fig 2 Stability of phenylhydrazine in water-methanol（65 ：35）（containing 0.2% sodium sulfite）2.3 苯肼在不同 pH 值溶液中的稳定性取苯肼，分别用水 - 甲醇（65 ：35）（用三乙胺调节 pH 至 11.0）与水 - 甲醇（65 ：35）（用磷酸调节 pH 至 2.0）2 种不同 pH 溶液溶解并稀释制成 4 g mL 1 的溶 液，立即置紫外分光光度仪中，在 226 nm 的最大吸收波 长处测定动力学数据。结果苯肼在 pH 11.0 的溶液中吸 光度在 1 h 内从 0.294 3 降至 0.253 9，降解了 13.7%，苯 肼在该溶液中的稳定性较中性溶液好，但仍难以满足测定 需要；而苯肼在 pH 2.0 的溶液中几乎没有降解（见图 3），增加测定时间至 3 h，吸光度亦无显著变化。结果提 示苯肼在酸性溶液中较稳定，可能是由于苯肼成盐后稳定 性增加所致。另配制 pH 3.0、4.0 等系列溶液同法测定， 结果苯肼稳定性依次降低，表明其稳定性与溶液 pH 值显 著相关，pH 2.0 的溶液基本能满足稳定性要求。2.4 流动相的优化文献 7 中采用 0.05 mol L 1 醋酸铵 - 乙腈（80 ：20） 为流动相，苯肼在该系统中峰宽较宽，并可能掩盖依达拉奉 二聚体等杂质，故对该系统进行优化。采用 0.05 mol L 1 磷酸二氢铵溶液（用磷酸调 pH 至 3.5）- 甲醇（65 ：35）为 流动相，结果苯肼峰形显著改善（见图 4），且流动相中 采用甲醇相对乙腈经济环保。图 4 优化前（A）与优化后（B）苯肼与依达拉奉 HPLC 图Fig 4 HPLC chromatogram of phenylhydrazine and edaravone before（A） and after（B）the optimization1. 苯肼（phenylhydrazine）；2. 依达拉奉（edaravone）3 方法与结果3.1 色谱条件色谱柱：Inertsil C18（150 mm4.6 mm，5 m）；流 动相：0.05 mol L 1 磷酸二氢铵溶液（用磷酸调 pH 至 3.5）- 甲醇（65 ：35）；流速：1.0 mL min 1；柱温：30 ；检测波长：226 nm；进样量：20 L。3.2 溶液的制备精密称取苯肼适量，用 0.05 mol L 1 磷酸二氢铵溶 液 - 甲醇（65 ：35）（用磷酸调 pH 至 2.0）溶解制成 4 g mL 1 的溶液作为对照品储备液；精密量取对照品 储备液适量，稀释制成 0.4 g mL 1 的溶液作为对照品 溶液。取依达拉奉适量，用溶剂溶解并稀释制成 1 mg mL 1 的溶液作为供试品溶液。空白溶液即不含苯肼的溶 剂溶液。3.3 系统适用性试验取依达拉奉适量，加入对照品储备液制成含苯肼 0.4 g mL 1 与依达拉奉 1 mg mL 1 的溶液作为混合溶液， 在“3.1”项色谱条件下进行测定，苯肼主峰理论塔板数 为 3 792，苯肼与依达拉奉峰的分离度为 12.8，空白溶剂 对测定无干扰（见图 5）。3.4 线性关系考察精密量取“3.2”项下对照品储备液 2、3、4、5、6、8 mL 分别置 50 mL 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀测定。 以峰面积（y）为纵坐标，浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。 结果苯肼在 0.16 0.64 g mL 1 的线性良好，回归方 程为 y 7.550104x 1.913103，r 0.999 9。3.5 最低定量限与最低检出限取“3.2”项下对照品溶液，用溶剂稀释制成系列浓 度的溶液，照“3.1”项下色谱条件测定。信噪比约为 10 时，溶液浓度为 56.3 ng mL 1，即苯肼最低定量限为 1.13 ng；信噪比约为 3 时，溶液浓度为 16.9 ng mL 1，即苯 肼最低检出限为 0.34 ng。3.6 精密度试验 815 Central South Pharmacy. August 2014, Vol. 12 No. 8 中南药学 2014 年 8 月 第 12 卷 第 8 期02.557.51012.5A1t/mint/minB21C02.557.51012.502.557.51012.5t/min图 5 对照品溶液 （A）、供试品溶液（B）、 空白溶剂（C）高效液相色谱图Fig 5 HPLC chromatogram of control solution（A），sample solution（B） and blank solution（C）1. 苯肼（phenylhydrazine）；2. 依达拉奉（edaravone）取同一份对照品溶液，连续进样 6 次，记录苯肼峰 面积并计算 RSD，结果 RSD 为 0.5%，该系统精密度良好。 3.7 重复性试验取依达拉奉 6 份，照“3.3”项下方法同法操作。结果 6 份样品均未见明显苯肼峰。3.8 回收试验取依达拉奉约 50 mg 共 9 份，置 50 mL 量瓶中，分 别精密加入“3.2”项下对照品储备液 4、5、6 mL 各 3 份， 照“3.3”项下方法操作，结果见表 1，说明方法回收率 良好。表 1 苯肼回收试验结果 Tab 1 Recovery of phenyhydrazine 液后置室温放置并观察颜色变化，结果甲醇水溶液颜色 变化明显且迅速，甲醇溶液与 pH 11.0 碱溶液次之， 添加抗氧剂与 pH 2.0 的酸溶液未见明显变色，颜色变 化程度与稳定性试验结果具有一定相关性。但苯肼在不 同溶液中稳定性存在差异的机制暂不明确，尤其是在添 加抗氧剂的溶液中苯肼吸光度存在波动的情况还需进一 步研究。4.2 苯肼应从严控制依达拉奉最大日剂量应 2 g，根据化学药物杂质 研究的技术指导原则，当原料药最大日剂量 2 g 时， 质控限度为 0.15%。由于苯肼毒性较大且生产过程中 易于控制，应当从严控制。国家 YBH10402008 依达拉奉 质量标准中苯肼限度为 0.04%，本方法可参考该标准制取样量加入量测得量回收率平均回收率RSD定限度。（sample（added（detected （recovery） （average/%4.3 质量标准有待进一步提高 weight）/mg amount）/g amount）/g/%recovery）/% 51.916.9317.31102.2102.30.851.116.9317.19101.551.416.9317.46103.149.621.1721.17100.099.61.150.821.1721.25100.350.321.1720.8598.453.425.4025.86101.8101.70.552.425.4025.96102.252.525.4025.71101.23.9 稳定性试验取“3.8”项下回收率中浓度溶液，分别于 0、1、2、4、 5、8、12 h 进样考察，记录主峰面积并计算 RSD 为 0.9%， 表明供试品溶液在 12 h 内稳定。3.10 耐用性试验取“3.8”项下回收率中浓度溶液，采用不同色谱柱 Inertsil C18（250 mm4.6 mm，5 m）、Hibar C18（250 mm4.6 mm，5 m）、不同流速（0.8、1.2 mL min 1）、 不同柱温（25、35 ）同法测定，结果该方法在色谱条 件存在一定改变的条件下苯肼峰形良好，并能与相邻峰 有效分离，耐用性良好。3.11 样品的测定取 3 批样品（批号：121009、121012、121015）， 依法制成供试品溶液，按“2.4”项下优化后的方法测定， 结果均未检出苯肼。4