《人类辅助生殖技术用医疗器械细胞相容性评价方法 囊胚染色和计数方法》征求意见稿

小组讨论稿ICS11.040.30C 30YY中华人民共和国医药行业标准YY/T XXXXXXXXX人类辅助生殖技术用医疗器械细胞相容性评价方法 囊胚染色和计数方法Medical devices for human assisted reproductive technologyA method used for staining blastocysts and cell number count（征求意见稿）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施国家药品监督管理局发布小组讨论稿YY/T XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语、定义和缩略语14试验方法2参考文献4前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位： 本标准主要起草人：5人类辅助生殖技术用医疗器械 细胞相容性评价方法 囊胚细胞染色和计数方法1 范围本标准规定了对小鼠囊胚细胞进行染色和计数的试验方法，适用于与配子和/或胚胎接触的人类辅助生殖技术用医疗器械的安全性评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16886.2 医疗器械生物学评价 第2部分：动物保护要求（GB/T 16886.2-2011， ISO 10993-2：2006，IDT）GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分： 样品制备与参照样品 （GB/T 16886.12-2017， ISO 10993-12：2012，IDT）YY/T 0995 人类辅助生殖技术用医疗器械 术语和定义YY/T 1434 人类体外辅助生殖技术用医疗器械 体外鼠胚试验3 术语、定义和缩略语3.1 术语、定义YY/T 0995和YY/T 1434中界定以及下列术语和定义适用于本标准。3.1.1扩张囊胚 expanded blastocyst囊胚腔已完全充满胚胎的囊胚。3.1.2 孵化囊胚 hatching or hatched blastocyst囊胚细胞部分或全部从透明带中逸出。3.1.3 内细胞团 inner cell mass (ICM) 囊胚内的一个细胞团，最终将发育成胎儿。3.1.4 滋养层细胞 trophectoderm cells (TE) 囊胚外层细胞，最终发育成胎盘等。3.2 缩略语 3.2.1 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）3.2.2 双苯酰亚胺（bisbenzimide,Hoechst 33342）3.2.3 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）3.2.4 牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 3.2.5 未分化的胚胎细胞转录因子1(The undifferentiated embryonic cell Transcription Factor 1，UTF1)3.2.6 CDX2（caudal type homeobox 2，CDX2）3.2.7 NANOG（Nanog homeobox，NANOG）3.2.8 DABCO (1,4-Diazabicyclo2.2.2octane solution ，DABCO)4 试验方法4.1 概述本试验利用荧光染料Hoechst33342与细胞核结合后在荧光显微镜下发蓝色荧光，从而对囊胚总细胞数进行染色。囊胚期胚胎细胞包括内细胞团（ICM）细胞和滋养层细胞（TE），内细胞团细胞表达UTF1（或NANOG）。通过免疫荧光染色，对囊胚期胚胎细胞表达UTF1（或NANOG）的内细胞团细胞进行染色。本试验在室温（2025度）条件下进行。4.2试剂1） PBS2） Hoechst 333423） 凡士林4） DABCO抗淬灭剂5） anti-UTF1抗体6） 与anti-UTF1抗体相对应的二抗7） DNA染色液4.3耗材1） 移卵装置2） 眼科镊3） 载玻片4） 盖玻片5） 培养皿4.4仪器1） 体视显微镜2） 荧光显微镜4.5试验过程4.5.1囊胚收集按照YY/T1434进行囊胚培养，收集所有囊胚,包括扩张囊胚和孵化囊胚。 4.5.2Hochest33342染料的准备配置Hochest33342染料储备液，将储备染料稀释成120微克/毫升浓度。4.5.3囊胚总细胞染色1）制备Hochest33342微滴并避光放置。2）将囊胚在PBS中漂洗12次，在多聚甲醛中固定半小时；在PBS中洗2次。2）最后放置到Hoechst 33342染色液染色10分钟。3）制片：取抗淬灭剂DABCO滴于载玻片上，将囊胚放到DABCO液滴上，液滴四周以凡士林支撑，将盖玻片轻轻压到液滴上，与凡士林接触后适当加压，使囊胚充分延展。4）荧光显微镜观察。4.5.4囊胚内细胞团染色1） 室温(2025)下，囊胚在PBS内漂洗3次；2） 室温(2025)下，囊胚在PFA中固定半小时，然后转移至透膜液中半小时，再以PBS漂洗胚胎10分钟，重复3次；3） 囊胚置于30%的动物血清（与二抗同源）13小时，以封闭非特异性的抗体结合位点；4） 在4条件下与一抗 （抗UTF1或NANOG）结合12小时 ；再以PBS漂洗胚胎10分钟， 重复3次；5） 室温下，在避光条件下与二抗结合1小时；再以PBS漂洗胚胎10分钟，重复3次；6） 根据二抗所联结的荧光色谱，将胚胎移至合适的DNA染色液中，在室温避光条件下孵化30分钟；7） 制片，置于室温避光条件下20分钟；8） 荧光显微镜观察。注: 上述免疫荧光染色可采用商品化的免疫荧光试剂盒完成。4.6结果分析4.6.1囊胚质量判断囊胚总细胞数5