生物技术与食品产业

第二章基因工程与食品科学 概述基因工程定义是指按人们的需要 用类似工程设计的方法将不同来源的基因 DNA分子 在体外构建杂种DNA分子 然后导入受体细胞 并在受体细胞内复制 转录和表达的操作 又称为DNA重组技术 基因工程的实施包括四个必要的条件 工具酶 基因 载体和受体 基因工程的内容和方法主要内容 分离制取带有目的基因的DNA片段 在体外 将目的基因连接到行当的载体上 将重组的DNA分子导入受体细胞并扩增繁殖 从大量的细胞繁殖群体中 筛选出获得了重组DNA分子的重组体 外源基因的表达和产物的分离和纯化 主要方法密度梯度离心 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 DNA序列结构分析以及人工合成 基因定点突变和PCR扩增等多种新技术 新方法 基因工程的分子生物学基础脱氧核糖核酸DNA变性 复性和杂交DNA的复制DNA的修复生物的基因重组基因遗传信息的传递方向 脱氧核糖核酸生物的遗传物质是DNA DNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的线状或环状生物大分子 由碱基 磷酸 戊糖组成 碱基由腺嘌噙 A 鸟嘌噙 G 胞嘧啶 C 与胸腺嘧啶 T 组成 DNA变性 复性与杂交DNA变性 DNAdenaturation 在高温及强碱长期保持下 双链DNA分子氢键断裂 两条链完全分离 形成单DNA分子 复性 renaturation 或退火 annealing 变性DNA分子经处理又可重新形成天然DNA分子 这个过程称 降低温度 pH及增加盐浓度均可促进DNA的复性 杂交 hybridization 当复性DNA分子由不同的两条链分子形成时 这种复性称为 DNA的复制复制是一个复杂的过程 可参看有关书籍 DNA复制特点 从特定的开始并按特定的方向进行 5 3 DNA分子的复性是半保留复制 DNA分子的复制是半不连续复制 DNA分子的复制是通过DNA聚合酶及各种相关的酶蛋白 蛋白因子的协同有序的工作完成的 DNA分子复制具有高度的精确性和准确性DNA分子复制的速度 细菌 104 105核苷酸 min 而在真核细胞中为500 5000核苷酸 min DNA的修复DNA复制时可能由于DNA聚合酶引发的偶然的错误 或者由于环境因素致使DNA产生序列上的错误 此时生物体内存在着的修复系统就会对DNA的变异起保护修复的作用 DNA修复主要包括三个步骤 DNA修复核酸酶对DNA双链上不正常的碱基的识别与切割 DNA聚合酶对已切割区域的重新合成 DNA连接酶对剩下切口的修补 基因基因是具有遗传疚的DNA片段 也是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位 2001 2 12由美 中 日 英 法等国宣布人类基因组草图完成 人类基因组由31 67亿个碱基组成 共有3万个左右基因现代研究表明 基因是一个功能单位 但不是一个不可分割的的最小的重组单位和突变单位 它包含若干个空谈子和重组子 移动基因 movablegene 是指一个或以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置 甚至在不同的染色体之间跃迁 故也称为跳跃基因 但这种移动只是移动一个拷贝 在原来的位置还保留一份拷贝 断裂基因 splitgene interruptedgene 基因编码序列中有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列 使一个基因分隔成不连续的若干区段 这种编码序列不连续的间断基因称为 断裂基因的表达程序是 先转录成初级转录物 又叫前体mRNA 然后经过删除和连接 除去无关的DNA间隔序列的转录物 便形成了成熟的mRNA分子 它从细胞核中输送到细胞质 再译成相应有多肽链 其中被剪除的DNA部分叫间隔序列或内含子 intron 被保留下来的DNA部分叫编码序列或外显子 exon 这种内含子的除和外显子的连接 形成成熟的mRNA的过程 称为RNA剪接 假基因 pseudogene 在真核生物中普遍存在 这是一类在基因中稳定存在 核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同 但却不能合成出有功能的蛋白质的失活基因 它是相应的正常基因空谈而丧失活性的结果 人类基因中与蛋白质合成有关的基因只占整个人类基因组的2 重复序列 repeatedsequence 是指在一个DNA分子中出现不止一次的序列 几乎所有的真核生物的基因组DNA中都有重复序列 在人类基因组计划中发现 35 3 的基因组包含重复序列 重叠基因 overlappinggene 是指一个基因的序列中 含有另一个基因的部分或全部序列 即其核苷酸序列是重叠的 基因重叠现象仅发现于一些噬菌和病毒基因组中 中心法则转录翻译DNARNA蛋白质反转录 基因重组目的基因与载体基因 标记基因等的连接叫基因重组重组质粒基因包括 标记片段 启动子 目的基因 终止子 载体基因片段 基因工程的一般操作步骤目的基因的获得载体的选择重组质粒的构建导入目标生物体细胞内转基因重组体的获得转基因生物的鉴定 基因工程的特点生物的基因可以在人类 动物 植物和微生物四大系统间进行交流可以大大缩短育种年限 变异可以定向 基因工程的基本原理和内容一 基本概念 染色体DNA 脱氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 基因中心法则 1 DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的 2 DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接 排在外侧 构成基本骨架 碱基排列在内侧 3 两条链上的碱基通过氢键相结合 形成碱基对 它的组成有一定的规律 人类染色体组示意图 细胞核示意图 动物细胞示意图 植物细胞示意图 DNA 脱氧核糖核酸 由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕中心轴的双螺旋结构 两条链中的碱基之间按照A配T G配C的互补原则 以氢键连接 其中A为 腺嘌呤T为 胸腺嘧啶G为 鸟嘌呤C为 胞嘧啶U为 尿嘧啶 RNA DNA直线排列于染色体上 存在于细胞核中 DNA有自我复制的能力 DNA自我复制示意图 DNA双螺旋碱基配对图 RNA 核糖核酸 存在于细胞质中分别有三种功能不同的RNArRNAtRNArRNAmRNA为遗传密码 由DNA转录而来 有关基因的概念 基因是含有一定功能的DNA片段 是遗传的基本单位 获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆 找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位置叫基因定位 测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫基因测序 按照一定的碱基序列 以核苷酸为原料 合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成 基因工程研究的对象 研究生物大分子 如 蛋白质 核酸 多糖等调节生命过程的物质 包括它们的结构 性状 代谢 分子生物学是基因工程的基础 工具酶 三大类 限制性内切酶连接酶修饰酶 Restrictionenzymes recognizespecificshortsequencesofDNAandcleavetheduplex sometimesattargetsite sometimeselsewhere dependingontype 识别序列常是一组含4 6个核苷酸的回文序列 是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶RestrictionmapisalineararrayofsitesonDNAcleavedbyvariousrestrictionenzymes DNA限制酶切片段沿染色体或染色体片段的依次排列称作限制图谱 限制性核酸内切酶的命名 按酶的来源的属 种名而定 取属名的第一个字母大写与种名的头两个字母小写组成的三个斜体字母作略语表示 如有株名 再加上一个字母 其后用大写罗马数码 区分同菌株种内具有的不同限制性修饰系统 例如 从流感嗜血杆菌d株 Haemophilusinfluenzaed 中先后分离到3种限制酶 则分别命名为Hind Hind 和HindIII BamH ClaIEcoR HindIII 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 是细菌内存在的保护性酶 分为I II III三类 限制性核酸内切酶的分类 II类酶识别序列特点为回文结构 GGATCC CCTAGG 三 限制性内切酶的切割位点 大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征 切断的双链DNA都产生5 磷酸基和3 羟基末端 不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端 钝性末端 bluntend flushend 粘性末端 stickyend cohesiveend 5 端突出粘性末端3 端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为4 8个bp 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端 compatibleend 可用连接酶连接 ABC RestrictionNucleases RestrictionNucleases 不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同 有的识别四核苷酸序列 有的识别六或八核苷酸序列 如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的 则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp 44 出现一次该酶的识别切割位点 同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4096bp 46 或65 536bp 48 出现一次识别切割位点 按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率 以便选用合适的内切酶 限制性核酸内切酶的种类很多 至今已发现近800多种 可以根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用 从而为基因工程提供了有力的工具 表列出了几种最常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点 几种最常用的限制性核酸内切酶 同裂酶 isoschizomers 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶位点序列 这类酶称为同裂酶 异源同工酶也用于分析甲基化HpaII和MspI均识别CCGG 其中 表示甲基化 甲基化后HpaII不可切 而MspI可以 同尾酶 isocaudamer 一些来源不同的限制酶 识别的是不同的核苷酸靶位点序列 但是产生相同的粘性末端 这类没酶称为同尾酶 如BamHIGGATCCBclITGATCABglIIAGATCTXhoIIUGATCYU嘌呤Y嘧啶 几个相关概念 限制性内切酶 是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶 限制性内切酶的类型及其特征 Figure2 1DNAcanbecleavedbyrestrictionenzymesintofragmentsthatcanbeseparatedbygelelectrophoresis Figure2 2Doubledigestsdefinethecleavagepositionsofoneenzymewithregardtotheother Figure2 3ArestrictionmapcanbeconstructedbyrelatingtheA fragmentsandB fragmentsthroughtheoverlapsseenwithdoubledigestfragments Figure2 5ArestrictionmapisalinearsequenceofsitesseparatedbydefineddistancesonDNA ThemapidentifiesthesitescleavedbyenzymesAandB asdefinedbytheindividualfragmentsproducedbythesingleanddoubledigests Genescanbemappedbyrestrictioncleavage Fourallelesforarestrictionmarkerarefoundinallpossiblepairwisecombinations andsegregateindependentlyateachgeneration PhotographkindlyprovidedbyRayWhite Figure2 6Apointmutationthataffectsarestrictionsiteisdetectedbyadifferenceinrestrictionfragments Howvariableareindividualgenomes Figure2 9Ifarestrictionmarkerisassociatedwithaphenotypiccharacteristic therestrictionsitemustbelocatednearthegeneresponsibleforthephenotype Themutationchangingthebandthatiscommoninnormalpeopleintothebandthatiscommoninpatientsisverycloselylinkedtothediseasegene 其他重要的酶 一 核酸酶Nuclease 1 外切酶exounclease2 内切酶endonuclease二 连接酶 Ligase 三 聚合酶polymerase四 DNA修饰酶modifyingenzyme1 碱性磷酸酶2 寡核苷酸激酶3 末端脱氧核苷酸转移酶五 拓特异构酶 核酸酶 nucleases 是指所有可以水解核酸的酶 按底物不同分为 DNA酶 DNase RNA酶 RNase 一 核酸酶Nuclease 按作用部位不同分为 5 末端外切酶核酸外切酶3 末端外切酶核酸内切酶限制性核酸内切酶 有严格的序列依赖性 是基因工程中的重要工具酶 核酸外切酶 exonuclease 是从核酸的一端开始 一个接一个把核苷酸水解下来 核酸内切酶 endonuclease 则从核酸链中间水解3 5 磷酸二酯键 将核酸链切断 很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解 1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶 能识别特定的核酸序列而将核酸切断 同时又伴随有特定的核酸修饰酶 最常见的是甲基化酶 能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化 从而避免受内切酶水解 外来核酸没有这种特异的甲基化修饰 就会被细胞的核酸酶所水解 这样细胞就构成了限制 修饰体系 其功能就是保护自身的DNA 分解外来的DNA 以保护和维持自身遗传信息的稳定 这对细菌的生存和繁衍具有重要意义 这就是限制性核酸内切酶名称中 限制 二字概念的由来 核酸外切酶 exonuclease E coli 只从一条DNA的3 端外切DNaseI对双链和单链DNA都进行剪切 在双链DNA上产生随机切口RNaseH特异性降解RNA DNA杂交分子中的RNA链 cDNA中二链的合成单链核酸内切酶BAL31攻击5 和3 的核苷酸 双链外切活性与单链内切活性S1endonuclease tungusAspergillusoryzae 只攻击单链DNA 包括双链中的单链 二 连接酶 Ligase 将核酸分接在一起 需要ATP供能 1 封闭作用2 连接两个分子 连接DNA链3 OH末端和相邻DNA链5 P末端 形成磷酸二酯键 从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链 反应需要ATP 四 DNA连接酶 DNAligase ATP DNA连接酶在复制 DNA修复 重组 剪接中均起缝合缺口作用 是重要的工具酶之一 DNALigase InsertDNAFragmentintoavector 三 聚合酶polymerase 复制合成新的DNA链 合成方向5 3 端 多数聚合酶都有3 5 的外切酶活性 每次以切除一个核苷酸的速度 在无dNTP存在情况下 可以对单链或双链3 OH端作用 但在dNTP情况下 对于双链DNA聚合活性将抑制外切酶活性 对于一些DNA聚合酶如E coli DNApolymerase 也有5 3 外切酶活性 一次可以切出一个至10个核苷酸 这个外切酶活性是发生在合成之前即前面切除 后面马上又合成 这反应就是缺口平移 nicktranslation 5 3 外切活性位于分子的N端 可以通过蛋白酶或缺失基因而除去 结果剩下的聚合酶保留了合成和3 5 外切酶活性 它就是Klenowfragment 或全称为E coliDNApol largefragment 这些都是DNA DependentDNApolynerase 如果是RNADependentDNApolynerase Reversetranscriptase鸟类骨髓母细胞瘤病毒 AMV T4DNApolymerse单个多肽分子112 1000 对单链和双链有很强3 5 外切酶活性并缺乏5 3 外切活性 它与Klenow都可以将双链突出端的DNA转变成钝端 但功能不一样 可以标记平端甚至3 突出 DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶 是DNA复制的主要酶 全称叫依赖DNA的DNA聚合酶 DNAdependentDNApolymerase 或DNA指导的DNA聚合酶 DNA directedDNApolymerase 均缩写为DDDP 一 DNA聚合酶催化的反应1 5 至3 的聚合活性催化四种dNTP一个一个地接到DNA链上去 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 聚合反应机理 聚合反应的特点 1 以单链DNA为模板 2 以dNTP为原料 3 引物提供3 OH 4 聚合方向为5 3 2 核酸外切酶活性 3 5 外切酶活性 切除错配的核苷酸 5 3 外切酶活性 切除引物切除突变的片段 二 DNA聚合酶的种类1 原核生物的DNA聚合酶 DNA polI 单一肽链的大分子曾被称为复制酶 replicase 含量最多可被水解成两个片段小片段 N端 具有5 3 外切酶活性 大片段 C端 具有聚合活性和3 5 外切酶活性 也称为Klenow片段 是常用的工具酶 DNA polIII 由10种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高 2 真核生物的DNA聚合酶 DNA pol 复制中延长随从链DNA pol 没有其他pol时才起作用DNA pol 催化线粒体DNA的复制DNA pol 复制中延长领头链DNA pol 校读 修复和填补缺口 三 复制的保真性 fidelity 至少依赖三种机制 1 遵守严格的碱基配对规律 2 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 3 复制中的即时校读功能 POLYMERASECHAINREACTION PCR DNAtobecopied A C G Tnucleotides DNApolymerase primersequence TaqDNA聚合酶 耐高温的酶 四 DNA修饰酶modifyingenzyme 1 碱性磷酸酶Alkalinephosphatase E coli或calfintastinaltissue 将DNA分子5 terninus的磷酸基团移去 2 多核苷酸激酶polynucleotidekinase E coliinfectedwithT4phage 与碱性磷酸酶功能相反 即将磷酸基团加到5 自由端 3 末端脱氧核苷酸转移酶Terminaldeoxyyaucleotidyltransferase calfthynustissue 在DNA分子的3 端加上一个或多个脱氧核苷酸 即可以作用于单链也可以是双链 不需要模板 可用于标记及连接 五 拓特异构酶 属于解旋解链酶类解开并理顺DNA双链 维持DNA处于单链状态 主要有解螺旋酶 DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白 一 解螺旋酶 helicase 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对 而碱基却埋在双螺旋的内部 只有把DNA解开成单链 它才能起模板作用 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质 当时称为rep蛋白 作用是利用ATP供能 解开DNA双链 复制相关蛋白的基因 dnaA dnaB dnaC dnaX相应的表达产物蛋白质 DnaA DnaB DnaC DnaXDnaA 辨认复制起始位点DnaB 解螺旋酶DnaC 辅助解螺旋酶使其在起始点上结合并打开双链 二 单链DNA结合蛋白 SSB SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白 HDP 在大肠杆菌 它是由177个氨基酸残基组成的同四聚体 结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位 SSB与解开的DNA单链紧密结合 防止重新形成双链 并免受核酸酶降解 在复制中维持模板处于单链状态 三 DNA拓扑异构酶 topoisomerase 拓扑 是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质 拓扑异构酶 是一类可改变DNA拓扑性质的酶 对DNA分子的作用是既能水解 又能连接磷酸二酯键 可松弛DNA超螺旋 有利于DNA解链 共价闭环DNA形成或解除超螺旋covalently closed circularDNA 拓扑异构酶I topoI 在原核生物曾被称为 蛋白 主要作用是切开DNA双链中的一股 使DNA解链旋转中不打结 DNA变为松弛状态再封闭切口 拓扑异构酶II topoII 在原核生物又叫旋转酶 gyrase 能切断DNA双链 使螺旋松弛 在ATP参与下 松弛的DNA进入负超螺旋 再连接断端 限制性内切酶应用 酶切图谱 基因克隆 RFLPs 基因组作图 酶切图谱 限制性图谱restrictionmap定义 描述DNA上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱 RestrictionMapping Maptheorderofgenes UsedifferentrestrictionenzymesindividuallyonsameDNAThenusebothenzymestogether Runall3samplesin3lanesofagel Matchupthepiecesbysize Orderisrevealed ExampleofR Mapping Use2enzymesEcoRIandBamHIEcoRIfragmentsare850 500 and300bpBamHI950 600 100bpBothEcoRIandBamHI600 400 300 250 100bp RestrictionMapping EcoRIBamHIBoth 950850600500400300250100 TheMap 100950600 500300850 100400300250600 BamHI EcoRI BothEnzymes TheMap The600and100bpfragmentsarecreat