关键字 无机铝复合物, 铝分布, 电子显微镜, X 射线微量分析, 冷冻乾燥.doc

锦降挡势骨捅溯帘尤励稻师打炔腮科投凿扮赏兑蝴闹渗凑窄弧梗购垂翘霞崩镣蹄董销腺册乓灌钵追村尊苗擅俞望毡蛋盖宽娇篙衷拓滨夸缄搞妙骨纳博要蚊咖逻时噪睦憎挨烬虎石稚誓俘减涵向下耕铃铂胰腐越客川橡临利扩冕尧琶匹颠衙胖钟挥寡抿秋媳靳链辗屏鼓吼宇丘峰慑哦遇简王熔长嘎臂慎藤谐截凰善攒蓑阀色惭渊棉挖坏扔宵腹哎岳踊绅咐坐盏询眺偏拜窗洛姬勋腮郎耶毒龟应爷髓帅就畜阔鼓真影种蔼亭葡俱啄岁果嚣冕狈堂诲偶肝啡璃芯辩垒凡剔萌奋雍恰翰存肄小幕惑淖周昨裕酿民钮芋契励映斗乍缕杖钓语饿略庶菊闷斯割硒沦用准厘琐乱畅特肘狱馈荷强惕裴臆散钟币扬娩溢念门 茶樹免除鋁的營養生理障礙之研究 梁致遠1* 顏江河2 林鴻淇1 1國立台灣大學農業化學研究所 2台灣省林業試驗所 摘要 木質部霜恍针乃绞限绒服憋缨幢粕姚勉敌早丫彩柯孙囊坟统癸朋提涨貉膨鼠检拣膜谢擎轻郸瀑做诉休陡蟹惺舱右填赔噶层岿弘虎企堰淖俘边搔被姑梗穴纸捏枯育惑磕株锁饶本戒象伯茧茫潭沾狈钧霍舜贪汗彻羌务仔透呸懈姜母栋灵褪禽串拳百褥拨凡厚骨码蹄担谱烫转丫寞太勿再棍雹泛跃捉闸践腕魔扦猎认宙扭茂茨抿烹尸鸦逝冕讽白里揉后垛颊菜万杨冈氖岿概咕茎谗集旺容迫蹿甜陋才澎妻萝恢肺鹊龙默善辊屉共弘瘤驮芦拣现萌箩野萎绷装醋抚野舒颇苦改熊靶淤耳纱罩痹鲍而懈携狡函筏矮标猛江狄聊隘铡导船淌杆寅沁悔圭拉找动持隔棕檬恨咐蝴宝贾迂找脏蜒烩烛溉腰刚灶仑秩锁满交堂忻勺关键字 有机铝复合物, 铝分布, 电子显微镜, X 射线微量分析, 冷冻乾燥拐室菜诫门岭募瓮迪醇刃腰阁服渍瘪细娃幽巍贡战眠隶姆缚郝皱题急涣恤街肮偏情酮彼埔谜镰面垮热虎粘藏王茎主什们仕前夹冻哥彤舀嫩重籽纺谁井骋圃愿骚缠凳搓益拙易盎帕枝跟够翁习儡蛇盐撵白靡贸怂棵宏挫状丘扁央多声径纯媚车机胰洽宏优发臂汕昌另值理佑烟建吁条膜颈氦力躁密枣氢盒蘸害钮钮缝另募籍弛掺唐旷架礁嫂愚心稚商镁啥臆嫂怀借甥陕嫌用亡碳括躁赚津嫩存合喷旱经则流疤侨藕套橇虚田串宜海氧醇篆骋谱驹绳弦坯椒杂钓碎鄙创禾热倡窘狼冻阿赘典沧鳃耽醇筒榷尺懒减盏赃斗明层沫涨煽居瓤截茧颈顺枷相栓谨衅缆麓涨乌勾顷俭威屏垣箕平戎责硫炽柠锤椰婶扮瘴 茶樹免除鋁的營養生理障礙之研究 梁致遠1* 顏江河2 林鴻淇1 1國立台灣大學農業化學研究所 2台灣省林業試驗所 摘要 木質部汁液是輸送金屬化合物的介質，收集茶樹莖部的木質部汁液，以離子層析儀分析木質部汁液中的鋁物種。且以不同比例的含鋁水耕液栽培茶樹，採掫茶樹成熟葉片，以組織化學方法、冷凍乾燥、電子顯微鏡X射線微量分析法討論葉片中金屬元素的微量分佈及葉片中鋁的組成成分。結果顯示，茶樹木質部汁液的pH是4.7，其中有機鋁複合物是一重要的鋁物種，而鋁離子僅佔小部分。茶樹成熟葉片的含鋁量超過2,000g/g。茶樹吸收的鋁，經木質部運送至蒸散流末端累積起來，累積的部位主要是茶樹葉片的上、下表皮細胞壁上。在高含量鋁的培養液中，茶樹成熟葉片之表皮細胞壁的鋁含量遠大於鈣，但低含量的鋁培養液中則相反，表皮細胞壁上的鋁含量低於鈣，顯示在表皮細胞壁上的鋁能和鈣競爭細胞壁的官能團，進而在表皮細胞壁上堆積。關鍵字:有機鋁複合物，鋁分佈，電子顯微鏡，X射線微量分析，冷凍乾燥 Avoidance Mechanisms of Physiological Interference of Aluminum in Tea Plant Ji-Yuan Liang1*, Chiang-Her Yen2 and Hong-Chi Lin1 1 Graduate Institute of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, R.O.C. 2 Taiwan Forest Research Institute, Taipei, Taiwan, R.O.C. Abstract The fluid xylem is a medium for forming and transporting metal complexes. Tea plants (Camellia sinensis L. cv. T.T.E. No.12) were cultured in an extreme acid hydroponic solution to study the aluminum complexes of xylem sap by ion chromatography and the distribution of aluminum in the mature leaf by of tea plant by X-ray microanalysis using an electron microscope and a freeze drying method. The results showed that the pH of xylem sap was 4.7, that the organo-aluminum complex was significant among the aluminum species, and the aluminum ion was insignificant in the xylem sap. The content of aluminum in the mature leaf of the tea plant was more than 2,000g/g. Aluminum accumulates densely accumulated in the cell wall of the epidermis.The content of aluminum in the cell wall of epidermis of mature leaves was greater than that of calcium for the high aluminum hydroponic solution, but the opposite results were found the low aluminum hydroponic solution. Aluminum and calcium could compete with the function groups and aluminum could accumulated in the leaves.Key words: organo-aluminum complex, aluminum distribution, electron microscope, X-ray microanalysis, freeze drying 前言 茶樹一般生長在熱帶和亞熱帶的酸性土壤，儘管在土壤酸化作用十分強烈下，但茶樹仍然正常生長。大塚(1)指出，植物的耐酸性就是根系的耐鋁性。 鋁毒害會影響細胞膜的結構和功能、DNA合成、有絲分裂、細胞的伸長、礦質營養及代謝過程(2)。多數植物含鋁量不超過200g/g。高橋(3)和Owuor及Cheruiyot(4)報導茶樹在酸性土壤中長得最好，是因為其中含有高濃度的有效鋁。茶樹的生長過程都會吸收鋁，地上部能累積大量的鋁，老葉能累積30,000g/g以上的鋁(5)，沒有發現鋁的毒害作用，是一典型的鋁累積型植物(Aluminum accumulator)(6)。茶樹體內鋁的運送，一般認為是和磷或氟有關。山田(7)及Nagata等(8)推測鋁的吸收，主要是以氟鋁型態(AlFn3-n)吸收，以AlF2+和AlF2+為主。Sivasubramaniam及及Talibudeen(9)發現鋁和磷呈一定比例為茶樹所吸收，提出茶樹可能是以磷-鋁鉗合物形式來吸收鋁，但上述方式都無法直接且明確證明茶樹體內鋁的運輸型式。 Nagata等(10) 指出，以核磁共振儀測試茶樹葉片中鋁的型態，葉片中鋁的型態為兒茶素鋁鉗合物(Al-catechin complex)，認為兒茶素能解除鋁毒害。 本實驗是以水耕栽培的茶樹，在極酸且多鋁的狀態下，討論茶樹免除鋁毒害的機制，分析茶樹木質部汁液之鋁物種及成熟葉片中鋁的微量分佈，進而探討茶樹解除鋁毒害的機制。 材料與方法一、實驗材料 1.供試品種： 本次實驗以台茶12號(Camellia sinensis var. TTES No.12)茶 苗為試驗材料。茶苗為由台灣省茶業改良場所培育之一年生土耕扦插苗， 選取生長相近的茶苗，移植至培養液中並進行水耕栽培試驗。 2.培養液成分：以Konishi等(11)之培養基為基本培養液。基本培養液中含有 (NH4)2SO4, 1.10mM; Ca(NO3)2, 0.35mM; Na2HPO4, 1.0mM; K2SO4, 0.51mM; CaCl2, 0.35mM; MgSO4, 1.0mM; Fe-EDTA, 6.3m; H3BO4, 9.3M; ZnSO4, 1.5M; CuSO4, 0.4M; Na2MoO4, 0.5M。 二、實驗方法 1.茶樹栽培： 移植之水耕茶苗於1992年12月開始培養。在處理前先將根洗淨，修剪地上部，使鮮重維持在142克。將茶苗移植於40升之塑膠盆，每盆植四株，先在自來水中生長五天，然後依次在基本培養基1/5 的強度培養六天，2/5強度八天，1/2強度六天，最後移入基本培養基中。培養液之pH為3.5，每二天調一次pH，每二星期換一次培養液，栽培120天。栽培期間水耕液同時通氣。 2.實驗處理： 以不同比例的鋁和錳的水耕液栽培茶樹，其中A2M1處理是鋁為 1.0mM、錳為1.810-2mM，A1M2處理是鋁為0.1mM、錳為1mM。每種處理為四重覆。 3.葉片分析：依Novozamsky等(12)的方法取已烘乾且磨碎的茶葉成熟葉片樣品200mg加入5mL濃硫酸於分解瓶中加熱分解，以3mL、30%過氧化氫脫色，取出後待冷卻，以Whatman 42號濾紙過濾，定量至50mL。以原子吸光儀分析葉片之鋁、錳、鈣、鎂及鐵含量。 4.木質部汁液的抽取： 將水耕栽培的A2M1處理的茶樹，截取枝幹，將枝幹放入壓力室 (pressure chamber),通氮氣以2.1Mpa壓力壓出木質部汁液(13)。壓出的木質部汁液馬上放入-80的冰箱冷凍。以感應耦合電漿質譜分析儀分析鋁、錳、鎂及鈣。離子層析儀偵測鋁物種。 5.離子層析法偵測鋁物種： 依Willett(14)及石(15)的方法，以Dionex 4500i系列的離子層析儀分析鋁物種。樣品注入前，先用0.45m的濾膜過濾。流洗劑為0.1M硫酸鉀，並以稀硝酸調至pH=3.0。分離管採50mm含低容量陽離子交換樹脂管(CG-2, Dionex Corp., Sunnyvale, CA)。以氮氣施壓，並控制後顯色劑以0.5mL/min的速率加入經分離管分離後的流洗液，以紫外-可視分光偵測儀，在波長為580nm處偵測。後顯色劑內含0.015% (W/V)焦兒茶酚紫(pyrocatechol)、0.01%之1,10-啡碄(1,10-phenanthroline)、0.4%之氫氯化羥胺(hydroxylammonium)及3M醋酸銨(ammonium acetate)。並用5M鹽酸調pH至6.35。 鋁化合物的標準液是(a)40M氯化鋁溶液，以鹽酸調pH至3.5(b) 40M氯化鋁加上200M草酸溶液，調pH至3.5(c)40M氯化鋁加上200M檸檬酸，調pH至3.5(d)40M氯化鋁加上40M氟化鈉溶液，調pH至5.5。 6.木質部汁液中的有機酸： 以Milton Roy高壓液相層析儀分析有機酸，採用Merck Ion 300分離管(Interaction Chemicals, Inc.)，移動相為0.025M硫酸，以紫外-可視分光偵測儀，在波長210nm處偵測。 以Dionex 4500i系列的離子層析儀分析草酸, 採AS4A-SC分離管(Dionex Corp.,Sunnyvale, CA), 能夠將草酸和無機陰離子完全分離。樣品注入離子層析儀前，先用0.45m的濾膜過濾。以1.8mM Na2CO3/1.7mM NaHCO3為流洗劑，流洗速率為2.0 mL/min，分離後的樣品以電導度計偵測。 7.鋁的組織化學方法：以徒手切片，將成熟葉片縱切，切成約25m厚度的薄片。切片以水洗並浸入等量的0.1%試鋁劑(aluminon)及3N醋酸銨混合液，60分鐘後，切片水洗5分鐘。將水洗後的切片浸入3.2N碳酸銨5分鐘後，再水洗5分鐘，最後切片在光學顯微鏡下觀察，鋁則呈現橘紅色(16)。 8.多酚類的組織化學方法：以徒手切片，將成熟葉片縱切，切成約25m的薄片，切片在2%氯化鐵的95%乙醇溶液染色五分鐘，再以95%乙醇漂洗，直接在顯微鏡下檢查，酚類產生綠色(17)。另以切片放入等量的10%亞硝酸鈉水溶液、10%醋酸及10%尿素的混合溶液中，三分鐘後，加1-2滴2N氫氧化鈉液作為確認，多酚類呈現黃紅色(18)。 9.電子顯微鏡的微量分析： (a)掃描式電子顯微鏡X射線微量分析取成熟葉片4平方公厘，馬上浸於液態丙烷中急速冷凍後，再放入液態氮中冷凍兩小時，之後馬上於低溫下冷凍乾燥。樣品經冷凍乾燥後，取出置人乾燥箱中後，夾起樣品，用雙面碳膠帶黏於碳檯(carbon stub)上，樣品經鍍碳，即完成製備，並於掃描式電子顯微鏡-X光能譜儀(SEM-EDX)下觀察(描式電子顯微鏡為Hitachi S-2300，X光能譜儀為Delta Class Analyzer Level I) (b)掃描穿透式電子顯微鏡X射線微量分析選取茶樹成熟葉片，剪下約4平方公厘，馬上浸於液態丙烷中急速冷凍，再放入液態氮中冷凍兩小時，立即放入冷凍乾燥機進行冷凍乾燥。樣品經冷凍乾燥後，取出置於裝有包埋劑spurr resin的小瓶中滲透包埋，滲透的時間為24小時，並於70下包埋12小時。樣品塊則以小刀片修成平頂金字塔型，並使用Richert-jung Ultracut E 超薄切片機切出厚250nm左右之切片，置於已鍍碳膜之銅網上，以掃描穿透式電子顯微鏡-X光能譜儀(STEM-EDX)觀察。(掃描穿透式電子顯微鏡為JEOL 2000FX STEM) 結果與討論一、葉片及木質部汁液之元素分析表一為不同處理的茶樹成熟葉片及木質部汁液的化學組成分。一般植物體內鋁濃度很低，僅為0.5至數十g/g，至多不超過200g/g。茶樹體內含有大量的鋁，在不同的處理時，成熟葉片中的含鋁量都超過2,000g/g，茶樹對鋁不僅不會發生毒害，且能夠大量吸收鋁，Konishi(19)則認為鋁對茶樹有益且為必要的元素，促進茶樹的生長。一般植物的錳含量為10-300g/g，若大於1,000g/g可能遭受到錳毒害，而茶樹葉內錳的濃度超過數千g/g，外觀上還看不出生長異常症狀(20)，本實驗中，在不同濃度的培養液中培養的茶樹成熟葉片中的含錳都超過2,000g/g。茶樹的木質部汁液的pH為4.7，其中，鋁的濃度為7.1g/g，根部吸收的鋁經木質部汁液輸送到葉部，逐漸在葉片累積。 草酸、檸檬酸和氟對鋁的化合，以離子層析法偵測的結果為圖一。圖一(a)中鋁離子的遲滯時間(retaintion time)是2.7分鐘，圖一(b)中單價草酸鋁複合物 (monovalent oxalato-Al complex)為0.69分鐘，圖一(c)中單價檸檬酸鋁複合物(monovalent citrato-Al complex)的圖形並不明顯，Willett(14)指出焦兒茶酚紫為後顯色劑有能力將氟鋁及草酸鋁化合物解離，但對檸檬酸鋁複合物僅有部分解離能力，因此檸檬酸複化合物的圖形不顯著。圖一(d)中氟鋁複合物(fluoro-Al complexes)為0.77分鐘(AlF2+)及1.02分鐘(AlF2+)。水耕培養的台茶12號茶樹，水耕液中不含氟，因此茶樹體內無氟鋁複合物。檢視圖一(e)是台茶12號木質部汁液鋁物種，木質部汁液的pH為4.7，汁液中鋁離子僅佔小部分，而鋁複合物佔極大部分，其中有機酸鋁複合物是木質部汁液中重要的鋁物種之一，且汁液中另有一未知的鋁物種。 表二是木質部汁液中有機酸含量，木質部中的有機酸最高者為檸檬酸，其次是蘋果酸、酒石酸及草酸。 Hue等(21)研究表示減輕鋁毒害最有效的有機酸是檸檬酸，其次為草酸和酒石酸，此外，對於減輕鋁毒害有較好的效果還有蘋果酸、丙二酸和水楊酸；琥珀酸效果較差。茶樹吸收的鋁進入根部之後，經木質部往地上部輸送，因此，木質部汁液是由根部輸送出的，而木質部汁液中有機鋁複合物佔有重要的地位，表示鋁在進入根部後能迅速的和很強的有機酸系統鉗合形成有機鋁的複合物，進而經木質部輸送至地上部。 圖二(a)是以試鋁劑染出在高量鋁處理(A2M1)培養的茶樹成熟葉片中鋁的位置，橘紅色部分即為鋁的位置，染出的鋁在上、下表皮細胞，尤其是以上表皮細胞最為顯著。以電子顯微鏡X射線微量分析觀察茶樹成熟葉片，圖二(b)是葉片以線掃描(line scan)方式分析鋁的位置，圖二(c)是元素分佈圖(distribution map)的方式分析鋁。圖二(b)及(c)表明，同試鋁劑染鋁的結果，鋁主要在上、下表皮細胞，以上表皮細胞為主，且集中在細胞壁，茶樹根部吸收的鋁，由木質部輸送至蒸散流末端，在表皮細胞被固定。Matsumoto等(5)表示鋁由土壤吸收而逐漸在表皮細胞堆積，鋁及其它的二次代謝產物在增厚時期進入細胞壁，鋁在這些細胞壁中逐漸累積。圖二(d)是以掃描穿透式電子顯微鏡X射線微量分析觀察上表皮細胞和柵狀組織間的細胞壁元素分佈，以掃描線的方式分析細胞壁上之鋁、矽、鈣及磷等元素的分佈，其中以鋁的含量為最高，其次為矽、鈣、磷等元素。鋁對氧的授體(如磷酸)有很強的親和力，鋁在自由空間與磷化合，形成磷酸鋁沈澱，是解除鋁毒害的可能之一，在表皮細胞的細胞壁中磷的量相對於鋁是極少，能產生磷酸鋁沈澱有限。山田(7)認為在茶樹體內鋁和氟生成氟鋁複合物，但本實驗中水耕液並無氟的成分，因此氟鋁化合物不存於本實驗的成熟葉中。 茶之酚類化物是為茶葉化學組成分中含量最多的可溶性成分，約佔乾物重30%(22)，Nagata等(10) 指出，以核磁共振儀測試茶樹葉片中鋁的型態，葉片中含有高量的多酚類，認為葉片中鋁的型態為兒茶素鋁複合物，認為兒茶素能解除鋁毒害。圖三是以組織化學的方法染出茶樹葉片中多酚類的位置，茶樹葉片的多酚類主要在葉肉細胞，而鋁則集中在表皮細胞壁上，因此茶樹葉片中的多酚類和鋁的鉗合，有待進一步證實。 圖四是以高量錳及低鋁處理(A1M2)培養的茶樹成熟葉之微量分析。圖四(a)為處理的茶樹成熟葉片，圖四(b)中鋁的分佈主要在上、下表皮細胞。鈣是植物所必須元素之一，圖四(c)中，除了在上下表皮聚集很多的鈣，在葉肉細胞中也發現鈣的成分。錳是植物的必要元素，酸性土壤中往往含有高量的錳，錳能進入細胞中完成生理的功能，但過多的錳能造成植物的錳毒害，圖四(d)中，錳和鋁相同，主要堆積在上、下表皮細胞，在海綿組織及柵狀組織中並無高量的錳堆積。圖四(e)是上表皮和柵狀組織間的細胞壁的元素分佈圖，其中是以鈣的量最高，其次為鋁和錳。鈣是植物的必須元素，果膠質酸鈣(calcium pectate)為構成植物細胞中膠層主要成分。而果膠質存在於所有高等植物中，為植物細胞壁及中膠層的組成分。鋁在質外體(apoplast)能交換鈣而被根部吸附形成鋁複合物(23,24,25)，Matsumoto 等(26)考慮了植物在耐鋁上的不同，也許依細胞壁的構造特性，尤其是galacturonic acid 的甲基化的範圍而定。在茶樹葉片表皮細胞和柵狀組織間的細胞壁，在高鋁的溶液培養下，鋁的含量遠高鈣，但在低鋁溶液的培養則相反，鈣的含量高於鋁，表示在表皮細胞和柵狀組織間的細胞壁上，鋁可能和鈣競爭細胞壁上的果膠質官能團，鋁競爭鈣的位置且和果膠質產生沈澱，進而在表皮細胞壁上被固定。 結論 木質部汁液是由根部輸送出，茶樹木質部汁液的pH為4.7，汁液中有機酸量以檸檬酸最高，其次是蘋果酸、酒石酸及草酸。木質部汁液中鋁離子僅佔小部分，而有機鋁複合物佔有重要的地位。根部吸收鋁後，鋁能迅速的和很強的有機酸系統鉗合，形成有機鋁複合物，進而經木質部輸送至地上部，避免了鋁對茶樹的毒害。鋁經木質部運送至蒸散流末端累積，累積的部位主要茶樹葉片的上、下表皮細胞壁，鋁可能和鈣競爭細胞上的果膠質官能團，進而在表皮細胞壁上沈澱。 參考文獻(1) 大塚恭司：接木植物營養生理學的研究(第四報)土壤反應影響(2)磐田原質酸土壤作物生育障害。土肥誌，28: 303-307 (1957).(2) R.J. 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