酶联免疫吸附测定法在食品微生物快速检测中的应用.doc

酶联免疫吸附测定法在食品微生物快速检测中的应用摘 要对酶联免疫吸附测定法( ELISA) 在食品微生物检测中的应用进行了分类论述， 主要包括双抗体夹心法、间接法测抗体和竞争法在食品微生物检测中的应用，对其应用前景作出了展望。关键字 微生物；快速检测；ELISA食品的安全性是食品必需具备的基本要素，然而在食品科技高度发展的今天，在世界各地仍不断发生各种各样的食品安全事故，食品安全问题再度成为人们关注的热点。近几年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的动态监测，结果表明，微生物源性食物中毒占居首位，高达39.62%1。随着食品工业的发展以及对食品安全的重视，传统分析方法已经远不能满足食品检测的需要，迫切需要灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法。因此，近年来世界各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，改进和开发了一些快速的检测技术和方法。快速检测及其自动化则是通过综合引用微生物学、化学、生物化学、生物物理学、免疫学以及血清学试验技术对微生物进行分离、检测、鉴定和计数。近年来，常用的微生物快速检测技术主要有6大类：一、载体法：包括快速测试片法、螺旋板系统法和滤膜法；二、代谢学技术：包括电阻抗法、微热量计技术和放射量技术；三、免疫学技术：包括免疫荧光技术( IFT)、酶联免疫吸附技术( EL ISA)和酶联荧光免疫吸附技术(V IDAS)；四、LAMP方法；五、分子生物检测方法：包括分子杂交、PCR和基因芯片；六、分析化学技术：包括高效液相色谱(HPLC) 、气相色谱( GC) 、气相色谱-质谱联用( GC-MS) 、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS) 等。其中酶联免疫吸附测定(ELISA)以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在食源性致病菌检测方面的应用也越来越受到人们的青睐。1酶联免疫吸附测定法的原理和特点酶联免疫吸附测定法(Enzyme- linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。11 ELISA的基本原理ELISA的基本原理是抗原抗体反应：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度2。12 ELISA的特点ELISA具有高度的敏感性和特异性，与常规的化学、生物学的检测方法比较，具有以下特点:检测时间短，操作简便。由于抗原抗体免疫反应的特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，可同时检测数十甚至上百个样品；而酶具有高效催化的特性，使得检测时间大大缩短，一般在几个小时内即可完成。灵敏度高。ELISA可对受检标本做定性和定量测定，对于一般抗原的检测限可达ng甚至pg水平，对微生物的检测限可达102cfu/mL103cfu/mL3。干扰性小。抗原抗体的免疫反应是特异性反应，抗体与抗原的结合是由抗原决定簇所决定，不同抗原的决定簇决定只有特异性抗体才可与之结合。因此它几乎不受其它因素如结构类似物等的影响。安全性高，污染少。因为灵敏度高，标准品的浓度可以很低，有机溶剂用量较少，减少对检测人员和环境的潜在危害 4。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。主要有双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法测IgM抗体和应用亲和素和生物素的ELISA等。食品工业中常用的主要是双抗体夹心法、间接法和竞争法。2双抗体夹心法在食品微生物快速检测中的应用双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。宋宏新等5以鸡抗O157:H7特异性脂多糖(LPS)抗体(IgY)为捕获抗体，酶标抗体(HRP-IgY)为检测抗体建立双抗夹心ELISA法检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法，确定了抗原浓度对数与OD450值的高度线性相关性，根据检测OD450值可从拟合回归曲线确定样品中的含菌量，含菌量104CFU/ml的食品样品可直接用双抗夹心法进行检测含菌量104CFU/ml的食品样品可增菌14h后检测。钟青萍等6研究双抗夹心ELISA方法在食品中志贺氏菌检测中的应用，研究获得纯化抗志贺氏菌IgY，经检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1320;以志贺氏菌免疫新西兰大耳白兔，获得抗志贺氏菌的兔抗体，效价可达112800。染菌的食品样品经选择性增菌后进行双抗夹心ELISA检测，含0.11cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌13h后可检出阳性反应，含110cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌11h后可检出阳性反应。T.Vrabcheva等7比较研究了用ELISA和固相萃取、免疫亲和TLC方法测定保加利亚玉米中的黄曲霉B1的发生率，结果表明3种方法的测定结果具有相关性。Zhongming Zheng等8用ELISA和HLPC方法测定了多种食品中的赫曲霉素A。3间接ELISA法和竞争ELISA法在食品微生物快速检测中的应用间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法，本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。李国等9研究了文蛤副溶血弧菌间接ELISA检测技术，其最低检测极限为1105cfu/mL，患病文蛤内脏团中副溶血弧菌的检出率为80%，无病症带菌文蛤中的检出率为15%，海水中副溶血弧菌的浓度低于最低检测极限。Tsai等10用EL ISA对奶酪和酸牛奶中的杂色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和产黄青霉进行了检测。Kundimi Sreenath等11用多克隆抗体间接竞争ELISA测定食品中赤藻糖醇，测定结果与所报道的用HLPC和GC法测定的结果甚为一致。Kim E. Sapsford 等12用便携式比色仪使96- well ELISA芯片小型化。Hilal Colak等13比较研究了竞争ELISA与高效液相色谱在检测土耳其白奶酪、Kasar奶酪和Tulum奶酪中黄曲霉素素M1时应用，结果表明用ELISA测定的AFM1含量结果与用HPLC法测定的结果呈现相关性。IHOCHEL等14用间接酶联免疫吸附测定法检测食品中空肠弯曲菌空肠亚种O:2，最终确定最优固化细胞浓度、多克隆鸡lg浓度、兔抗lgY抗体-山葵过氧化酶结合物浓度分别为3.1CFU/nL，10g/mL，8g/mL。E.Razzazi-Fazeli等15用ELISA和HPLC法对印度尼西亚市场零售的婴儿食品、花生和谷物中的黄曲霉毒素B1和总黄曲霉毒素进行测定。4ELISA在食品微生物快速检测方面的应用前景ELISA具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达ng甚至pg水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但它也存在着一些缺陷:如由于免疫反应特异性强，对试剂的选择性高，致使很难同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物和很不稳定的化合物有一定的困难。为了弥补这些不足，许多学者正致力于改进和完善ELISA检测技术的研究，为了避免交叉反应，现已开始由单克隆抗体来代替多克隆抗体；纯化抗体和抗原；选择吸附性更高的载体和寻找最佳ELISA工作条件及定量方式等几个方面。目前，ELISA在医学领域应用比较成熟，这主要归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。而在食品微生物快速检测方面刚刚起步，需要进一步研究应用于各种微生物的试剂盒、自动及半自动检测仪器以及可以与其它技术的联用等。参考文献1 唐福勇.我国食品安全面临考验主要是微生物污染N.中国经济时报，2004-11-24.2 叶玫，吴成业.酶联免疫吸附法在水产品安全检测中的应用J.上海水产大学学报，2002，11(2):1711753 赵志晶，刘秀梅.大肠杆菌O157 多克隆抗体及食品中双抗ELISA测定方法的研究J.卫生研究，2003，32 (6):6066094 窦勇，宁喜斌，胡佩红.ELISA在水产微生物检测中的应用J.食品研究与开发，2006，27(8):1431465 宋宏新，马冬，薛海燕等. 双抗夹心ELISA法定量检测食品中大肠杆菌O157:H7初探J. 食品科学，2008， 29(10):5285306 钟青萍，葛萃萃，张世伟等.检测食品中志贺氏菌的双抗夹心ELISA方法的研究J. 食品科技，2007，10:1992027T.Vrabceva ， J.Stroka ， E. 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Comparison of a competitive ELISA with an HPLC method for the determination of aflatoxin M1 in Turkish White， Kasar and Tulum cheesesJ. Eur Food Res Technol， 2006(223) : 71972314 I. HOCHEL，D. VIOCHNA， J. KVORb, M. MUSIL. Development of an Indirect Competitive ELISA for Detection of Campylobacter jejuni subsp. jejun