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第二章环境设施 主讲教师 侯晓林博士后北京农学院教授 实验动物质量控制遗传质量控制微生物质量控制环境质量控制营养质量控制 第二章实验动物的环境与设施 第一节实验动物的环境因素 一 环境因素的重要性 动物的环境是指影响动物进化 生态反应和生长的所有外界条件的总和 动物实验是对演出型施加一定的处理 为求得动物对处理结果的可重复性 就要求演出型的稳定 R A B C D E式中R 实验动物的总反应 A 动物种的共同反应 B 品种及品系特有的反应 C 个体反应 个体差异 D 环境影响 E 实验误差 由公式可以看出 A B C属遗传因素 而D是环境因素 与动物的总反应呈正相关 必须尽量减小D的变化 尽量排除实验处理以外的影响 这就充分显示了环境在实验动物和动物实验中的重要性 二 环境因素的分类 1 气候因素 2 物理 化学因素 3 居住因素 4 营养因素 5 生物因素 6 同种动物因素 7 异种生物因素 环境对动物的影响并非仅仅受上述诸因素中单一一个因素的作用 而是受到诸多因素的复合作用 称之为环境的复合状态 三 环境因素的影响 1 温度在一定的温度范围内 动物有自行调节使之适应环境温度的能力 温度对实验动物的影响表现在生殖 泌乳 机体抵抗力 生长 形态 新陈代谢和实验反应性等诸方面 三 1 温度 最适宜温度20 25 温差 3或4 温度对动物的影响 新陈代谢 低温时新陈代谢增加 摄食增加散热 除灵长类 其他动物汗腺不发达或无汗腺 高温时散热困难 难以维持体温恒定脏器重量 负相关生殖 高温时雄性睾丸萎缩 精子活力下降 雌性动物性周期紊乱 泌乳下降对动物实验的反应性 不同温度对药物LD50的影响 mg kg 药物15 5 26 7 苯异丙氨197 090 0盐酸脱氧麻黄碱111 033 2麻黄碱477 1565 0 2 湿度空气湿度的大小对动物的散热率有显著响 高温 高湿的环境 尤其不利于动物的散热 相湿度低 动物摄食量 活动量增加 高温高湿导致机体蒸发散热受阻 高湿利于微生物繁殖和传播 湿度过低可导致粉尘飞扬 而微生物主要附着在粉尘上 动物室内变态反应原的含量随湿度的下降而上升 低湿 散热增加 产热增加 摄食增加低湿 大鼠环尾症 3 噪声60dB以下音域 人1000 2000Hz 小鼠1000 5000Hz 噪声是动物舍中日常活动及机械运行中发生的环境可变因素之一 动物可听到人类所听不到的音响 噪声对动物生理行为的影响很大 噪声是有害的声音 是使实验动物发生应激反应的常见病因 噪声对实验动物生殖生理具有严重不良影响 引起小鼠听力性痉挛 对生殖影响较大 如豚鼠流产 引起动物呼吸 心跳 血压 肾上腺皮质激素等生理指标变化 4 照明可见光线对动物机体有多种功能 光对动物的生殖系统是一个强烈的刺激因素 起定时器的作用 光照强度与致癌物质引起的小鼠皮肤炎 白血病有关 并影响小鼠的活动及一般行为 照度对动物的生殖生理和行为活动有较大影响强光长时间照射引起角膜退行性变化工作照度150 300lx动物照度15 20lx明暗交替时间12 12或10 14h 5 气流及风速气流的大小与体热的发散有关 实验动物单位体重与体表面积的比值较大 对气流更加敏感 气流速度和散热正相关 气流速度过大或气流直吹 动物体表散热过大 气流速度小 散热慢 0 1 0 2m s病原微生物随空气流动而四处散播 换气次数 洁净程度越高 要求换气次数越多 屏障环境 10 20次 h隔离环境 20 50次 h 压强梯度 洁净区高于污染区合理组织气流和风速可调节室内温度和湿度 又可降低室内粉尘和有害气体污染 控制传染病的流行 6 气体污染污浊的气体 CO2量的增加和O2量的减少 都会对动物生理代谢产生影响 浓厚的雄性小鼠汗腺分泌物的臭气会造成雌性小鼠性周期紊乱 气体污染 氨14mg m3有害气体 氨 甲基硫醇 硫化氢等颗粒污染 100级 10000级 100000级美国宇航局标准 每立方英尺空气中直径0 5微米以上粒子的个数 粒粉尘是变应原 还是微生物的主要载体 落下菌数 0 隔离环境 3 屏障环境 或30个 皿 普通环境 在不饲养动物的状态下每5 10m2放置1个直径9cm的血琼脂培养皿 暴露30min培养48h的菌落数 7 其他因素 1 饲料和饮水 饲料和饮水是保证实验动物正常发育 维持生长和繁殖所必须的 2 饲养管理 饲养动物的笼具 笼架 垫料 给水 给料器也会对动物健康产生影响 3 动物的种间影响 在实验动物中 种之间常有共患的传染病 健康的豚鼠放入有隐性感染支气管败血杆菌的兔房中 豚鼠就会发病 4 动物社会 动物只要有两只以上在一起 就形成动物社会 产生个体间地位的不同 猴 兔 狗 鸡和猪的社会会地位是直线型 第一位的首领可统治第二位以下 第二位的可统治第三位以下 以此类推 鼠 猫组成专制型社会地位 首领以下不发生统治关系 5 饲养密度 动物居住环境中的饲养密度不同会引起动物的反应不同 过密饲养群使体重的增加与饲料效率减低 且肠内菌丛常增加 6 病原微生物 各种病原微生物对实验动物的影响是显而易见的 7 日常管理 在平时的正常饲养管理动作中 如物品移动 动物运输 清洁卫生的方式和程序 消毒药物的选择和应用 垫料选择及处理 饲喂方式等都会作用于动物 8 人员素质 动物是由人饲养 管理和进行实验操作的 不言而喻 饲养管理人员的素质和健康 直接影响他饲养的动物品质 第二节实验动物的环境要求 一 温度1 临界温度 动物的体温失去恒定性而开始下降或上升时的环境温度称为临界温度 2 温度允许范围见下表 二 湿度一般说来 相对湿度在40 70 之间动物完全可以适应 50 5 最好 三 噪声目前国际上没有统一的噪声标准 大部分国家规定不得超过50 60dB四 照明一般认为实验动物应该养在一种近似天然日光的照明中 但实践中用白色灯及荧光灯进行的完全人工灯光照明 对动物没发现不良后果 五 气流 气压与通风换气国际上一般认为动物室的静压要比走廊高出2 5mm水柱 而走廊又比动物室外高出2 5mm水柱 隔离器及灭菌传递柜的内部也应比外部高出8 15mm水柱 对于风速标准 其理想标准是13 18cm s动物室的通风换气 一般规定均为12 15次 h 六 空气洁净度实验动物比人对空气质量要求高 其洁净指1L空气中所含粒径 0 5um的尘粒总数 分类依次为3 30 300级等 七 氨气大多数国家将动物设施中氨浓度的上限定为20mg L 八 动物生活空间见下表 实验动物中心屏障环境特点 恒温 20 26 恒湿 40 70 足够的换气次数 10 20次 小时 保证有害气体浓度降低到最小正向梯度压差 20 50 使屏障外污染源不能进入万级空气洁净度保证空气洁净适合的动物照度 15 20 和对时明暗交替 12h 12h 符合动物生活习性 11楼IVC系统为动物提供更好的保护 第三节实验动物设施实验动物设施laboratoryanimalfacility LAF是进行实验动物饲养 保种维持 生产 实验研究 试验等设施的总称 包括实验动物繁育 生产设施和动物实验设施 一 实验动物设施的一般要求 实验动物设施一般应达到下列基本要求 1 设施应选在远离疫区和公害污染的地区 有便利和充足的后勤供应 水 电 给排水系统和交通运输等 2 设施建设应坚固 耐用 经济 有防虫 鸟和鼠等野生动物的能力 施工和建筑材料要严格符合设计要求 最好预留可扩大的余地 3 设施最好为独立结构 具有各种完整的相应职能区域 做到区域隔离以便满足对各种不同动物品种 品系饲养和保证动物质量的需要 4 必要的保证满足设施功能 环境和微生物控制的设备的措施 5 应能保证动物健康 人员安全 并不对周围环境造成污染 6 适当地防灾和安全 应急发电 防火 防生物污染 防灾等突发事故 应对措施 保证设施正常运转 二 实验动物设施的分类及特点 1 开放系统 实验动物的生存环境直接与大气相通2 屏障系统 动物生活在气密性很好的设施环境内 设施内外空气交流中能通过特定的通道进入和排出 3 隔离系统 隔离系统是饲养无菌动物和悉生动物所使用的设施 实验动物中心屏障环境特点 恒温 20 26 恒湿 40 70 足够的换气次数 10 20次 小时 保证有害气体浓度降低到最小正向梯度压差 20 50 使屏障外污染源不能进入万级空气洁净度保证空气洁净适合的动物照度 15 20 和对时明暗交替 12h 12h 符合动物生活习性 屏障系统 实验动物垫料 屏障系统 IVC IndividuallyVentilatedCages IVC的特点 IVC IndividuallyVentilatedCages 是独立通风笼盒的简称 它的特点是具有一定的密闭性 同时让经HEPA过滤器的洁净空气流入盒内 使盒内保持正压 减少了可能的感染来源 适合于饲养SPF级动物 以及一些免疫缺陷动物 屏障系统 层流架 隔离系统 隔离器的基本构造示意图 环境级别和动物级别的对应关系动物级别环境级别 洁净度 落下菌 普通动物开放系统 30 清洁动物屏障系统 万级 3 SPF动物屏障系统 万级 3 无菌动物或悉生动物隔离系统 百级 0 三 特殊动物实验设施感染动物实验设施放射性同位素动物实验设施 RI 特殊化学物质动物实验设施 是感染动物实验设施 指使用病原体对动物进行实验感染的设施 此种设施除备有通常动物设施要求外 还必须具备防止由动物传染人 动物相互间的交叉感染 动物向设施外感染的结构和功能 不同生物危害因素其危害的严重程度和传播 扩散的难易不同 以病原微生物危害严重程度为分类依据 可把这类设施的生物安全控制水平即生物安全划分为四级 与其相应的是四级 即P1 P4或BSL 1 BSL 4 感染动物实验设施 此类设施设计的目的是防止生物性危险和有害因素向动物实验设施和外界的污染 目前通常采用物理学隔离 主要是在气密性结构内采用负压通风 以达到防止气溶胶扩散污染的目的 NIH P1 P2 P3 P4美国疾病管理中心 BSL1 BSL2 BSL3 BSL4 我国2004 5 1颁布 10 1实施 实验室生物安全通用要求 国家标准 一级 对健康成年人已知无致病作用的微生物二级 对人或环境具有中等潜在危害的微生物 三级 通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素 通常已有预防传染的疫苗 艾滋病病毒的研究 血清学实验除外 应在三级生物安全防护实验室中进行 四级 对人体具有高度的危险性 通过气溶胶途径传播或传播途径不明 目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素 以及上述情况类似的不明微生物 第三节屏障系统管理 一 人流路线 二 物流路线 三 消毒与灭菌高压锅 121 0 11Mpa 30分钟132 0 21Mpa 15分钟传递窗 紫外线 表面消毒 30分钟渡槽 0 1 新洁尔灭浸泡4小时Co60照射2 过氧乙酸喷雾高锰酸钾 福尔马林熏蒸 引进动物进入清洁级屏障动物房 从外面引进的动物必须有与其适用范围相符的实验动物生产许可证 同时必须附带动物的品系 性别 年龄等信息经实验动物中心工作人员审查后方可准备进入动物房 动物运输时必须有合格的包装箱 清洁级及以上动物包装箱必须以高效滤膜封闭窗口 包装箱以胶带封口 封口破损或滤膜破损者不得传入屏障系统 将检查合格的动物包装箱在外准备间以70 酒精棉球或5 碘伏仔细擦拭表面 将包装箱放入灭菌通道进行喷雾消毒或紫外线消毒 四 废弃动物处理深埋或焚烧 环境级别和动物级别的对应关系动物级别环境级别 洁净度 落下菌 普通动物开放系统 30 清洁动物屏障系统 万级 3 SPF动物屏障系统 万级 3 无菌动物或悉生动物隔离系统 百级 0 三 实验动物设施的组成及配套设备 1 饲育室动物生活的区域 包括育种群 扩大群 生产群 待发室和实验饲育室等 2 隔离检疫室接受引进动物做验收 检疫 隔离观察的区域 3 清洗 灭菌区对饲养器具及消耗品等进行清洗和消毒灭菌的区域 4 机械区包括锅炉 制冷机 风机 空调机的机械室 水处理室 变电室和自家发电室 5 物料接收和贮藏区由接收和贮藏饲料 垫料 饲育器具和各种消耗品的仓库组成 6 动物实验区进行动物实验的场所 包括诊断室 外科手术室 X射线室和解剖室等构成 7 管理区由管理办公室 生产技术室 会议室 中心控制室和工作人员休息室等组成 8 废弃物区设有内走廊尽可能划分清洁和污物两种功能走廊 9 走廊设施内走廊尽可能划分清洁和污物两种功能走廊 见下图 第四节实验动物设施的建设 一 设计原则1 遵守法规2 明确建设目的3 以国家实验动物的相关标准为设计依据4 设施的可持续发展5 节能问题6 设计人员的合理组成7 设计指导思想 第五节实验动物的环境控制与监测 一 实验动物的环境控制 1 主要进风口空气洁净度及各进风口风速的定期测定 通过测定探索出各级空气过滤器滤材的更换时间 确保进风量及空气洁净度是维持通风换气 气压梯度的主要关键 2 随时检查气密性问题 更换在气密性控制中的易损部件和材料 3 严格执行清洁卫生制度 及时清除动物