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第二章气相色谱分析 2 1气相色谱法概述色谱法 chromatography 以试样组分在固定相和流动相间的溶解 吸附 分配 离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法 色谱柱 进行色谱分离用的细长管 固定相 stationaryphase 管内保持固定 起分离作用的填充物 流动相 mobilephase 流经固定相的空隙或表面的冲洗剂 按固定相的几何形式分类 1 柱色谱法 2 纸色谱法 3 薄层色谱法 按两相所处的状态分类 气相色谱法 液相色谱法 气 固色谱法 液 固色谱法 气 液色谱法 液 液色谱法 气相色谱仪通常由五部分组成 载气系统 气源 气体净化器 供气控制阀门和仪表 进样系统 进样器 汽化室 分离系统 色谱柱 控温柱箱 检测系统 检测器 检测室 记录系统 放大器 记录仪 色谱工作站 国产气相色谱仪 图1 色谱过程图2 色谱图 A B KA KB 色谱图 chromatogram 试样中各组分经色谱柱分离后 按先后次序经过检测器时 检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号 由记录仪所记录下的信号 时间曲线或信号 流动相体积曲线 称为色谱流出曲线 色谱图界面 常用术语 基线 在操作条件下 仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线 峰高与峰面积 色谱峰顶点与峰底之间的称为峰高 peakheight 用h表示 峰与峰底之间的面积称为峰面积 peakarea 用A表示 峰的区域宽度 a 峰底宽Y 4 b 半高峰宽Yh 2 2 35 c 标准偏差峰宽Y0 607h 保留值 1 保留时间 从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时间tR 2 保留体积 从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积 VR 死时间 不被固定相滞留的组分 从进样至出现浓度最大值时所需的时间称为死时间 deadtime tM 死体积 不被固定相滞留的组分 从进样至出现浓度最大值时流动相通过的体积称为死体积 deadvolume VM qv 0为柱尾载气体积流量 VM tMqv 0 调整保留值 1 调整保留时间 扣除死时间后的保留时间 tR tR tM2 调整保留体积 扣除死体积后的保留体积 VR VR VM或VR tR qv 0相对保留值 relativeretention 在相同的操作条件下 待测组分与参比组分的调整保留值之比 用ri s表示 相对保留值应该与柱长 柱径 填充情况 流动相流速等条件无关 而仅与温度 固定相种类有关 当ri s 1时两个组分不能分离 色谱分析的实验依据 根据色谱峰的位置 保留时间 可以进行定性分析 2 根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析 3 根据色谱峰的展宽程度 可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价 2 2气相色谱分析理论基础一 分配平衡的几个参数 1 分配系数 distributioncoefficient 在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相间达到分配平衡时的浓度比值 用K表示 2 容量因子 capacityfactor 在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的质量比 称为容量因子 也称分配比 用k表示 cs cm分别为组分在固定相和流动相的浓度 g ml Vm为色谱柱中流动相的体积 近似等于死体积 Vs为色谱柱中固定相的体积 3 分配系数和分配比之间的关系分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关 而取决于组分及两相的性质 并随柱温 柱压变化而变化 容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质 随柱温 柱压的变化而变化 还与流动相及固定相的体积有关 理论上可以推导出 Phaseratio 相比 b VM VS 反映各种色谱柱柱型及其结构特征填充柱 Packingcolumn 6 35毛细管柱 Capillarycolumn 50 1500 色谱过程的基本方程式 二 色谱分离的基本理论 色谱理论需要解决的问题 色谱分离过程的热力学和动力学问题 影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径 柱效与分离度的评价指标及其关系 组分保留时间为何不同 色谱峰为何变宽 组分保留时间 色谱过程的热力学因素控制 组分和固定液的结构和性质 色谱峰变宽 色谱过程的动力学因素控制 两相中的运动阻力 扩散 两种色谱理论 塔板理论和速率理论 塔板理论的假设 1 在每一个平衡过程间隔内 平衡可以迅速达到 2 将载气看作成脉动 间歇 过程 3 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 4 每次分配的分配系数相同 一 塔板理论 柱分离效能指标 1 塔板理论 platetheory 半经验理论 MartinandSynge1941 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程 将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程 分离过程如下图所示 塔板理论认为 一根柱子可以分为n段 在每段内组分在两相间很快达到平衡 把每一段称为一块理论塔板 设柱长为L 理论塔板高度为H 则三者的关系为 n L H 保留时间包含死时间 在死时间内不参与分配 有效塔板数 neff 的计算公式为 通常用有效塔板数 neff 来评价柱的效能比较符合实际 neff越大或Heff越小 则色谱柱的柱效越高 Heff L neff 练习 例 在柱长为2m的5 的阿皮松柱 柱温为1000C 记录纸速度为2 0cm min的色谱条件下 测定苯的保留时间为1 5min 半峰宽为0 20cm 求理论塔板数 解 塔板理论优缺点 成功处 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR阐明了保留值与K的关系评价柱效 n 存在问题 1 做出了四个与实际不相符的假设忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2 只定性给出塔板高度的概念 却无法解释板高的影响因素3 排除了一个重要参数 流动相的线速度u 因而无法解释柱效与流速关系更无法提出降低板高的途径 2 速率理论 J J VanDeemter1956 速率理论认为 单个组分粒子在色谱柱内固定相和流动相间要发生千万次转移 加上分子扩散和运动途径等因素 它在柱内的运动是高度不规则的 是随机的 在柱中随流动相前进的速度是不均一的 A项为涡流扩散项 B u项为分子扩散项 Cu为传质项 u为载气线速度 单位为cm s 范第姆特方程式 VanDeemterequation 1 涡流扩散项 多径扩散项 A 产生原因 载气携样品进柱 遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同 涡流扩散 影响因素 固体颗粒越小 填充越实 A项越小 讨论 注 颗粒太小 柱压过高且不易填充均匀填充柱 60 100目空心毛细管柱 0 1 0 5mm A 0 n理较高 2 纵向扩散项 分子扩散项 B u 产生原因 峰在固定相中被流动相推动向前 展开 两边浓度差 影响因素 讨论 续前 注 为降低纵向扩散 宜选用分子量较大的载气 控制较高线速度和较低的柱温 选择载气原则 兼顾分析时间和减小纵向扩散u较小时 选M较大的N2气 粘度大 u较大时 选M较小的H2气 He气 粘度小 3 传质阻力项 C u 产生原因 样品在气液两相分配 样品未及溶解就被带走 从而造成峰扩张 影响因素 续前 讨论 注 固定液应完全覆盖载体表面 不可以太薄 否则柱子寿命短 k太小 T不可以超过固定液最佳使用温度 小结 范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中 填充均匀程度 填充物的粒度 流动相的种类及流速 固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响 2 3色谱分离条件的选择一 分离度 resolution 相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比 用R表示 分离度可以用来作为衡量色谱峰分离效能的指标 R越大 表明两组分分离效果越好 保留值之差取决于固定液的热力学性质 色谱峰宽窄反映色谱过程动力学因素及柱效能高低 对于峰形对称且满足正态分布的色谱峰 R 1 分离程度为98 R 1 5 分离程度可达99 7 所以R 1 5时可认为色谱峰已完全分开 二 色谱分离基本方程设两相邻峰的峰宽相等 即Y1 Y2 则 又知 另 称为柱效项 称为柱选择项 容量因子项 相对保留因子 与柱效的关系 柱效因子 与容量因子的关系 R n1 2 增加柱长 减小塔板高度 限制 L过长 保留时间延长 分析时间延长 色谱峰扩展 使用性能优良的色谱柱 并选择最佳分离条件 k值增大 有利于分离 但k 10时 对R的增加不明显 也会显著增加分析时间k的最佳范围 1 10 与柱选择性的关系分离度 柱效 柱选择性的关系 r2 1越大 柱选择性越好 分离效果越好 如果两个相邻峰的选择因子足够大 则即使色谱柱的理论塔板数较小 也可以实现分离 例题 设有一对物质 其r2 1 1 15 要求在Heff 0 1cm的某填充柱上得到完全分离 试计算至少需要多长的色谱柱 解 要实现完全分离 R 1 5 故所需有效理论塔板数为 使用普通色谱柱 有效塔板高度为0 1cm 故所需柱长应为 三 色谱条件的选择1 载气流速的选择 与分析时间 柱效有关 实际工作中 为了缩短分析时间 常使流速稍高于最佳流速 2 柱温的选择柱温是影响分离的最重要的因素 其变化应小 0 xoC 选择柱温主要是考虑样品待测物沸点和对分离的要求 柱温通常要等于或略高于样品的平均沸点 分析时间20 30min 能使沸点最高的组分达到分离的前提下 尽量选择较低的温度 当然被测物的保留时间要短 峰形不能有严重拖尾 对宽沸程的样品 应使用程序升温方法 以实验优化选择的条件为工作条件 程序升温与恒温对分离的影响比较 3 固定液与担体的选择 与相比有关 由实验手册查出参考值 再由实验选择 4 汽化室与检测室温度 与被测对象的利用度有关 汽化温度 检测室温度高于柱温30 70度 5 进样量 与柱容量有关 根据担液比及柱子形式决定进样量 进样方式为柱塞进样 2 4固定相及其选择一 固定相的类型 吸附剂型固定相固定相 担体 固定液型固定相常用吸附剂型固定相有 常用担体 固定液型固定相中 常用担体有 1 红色担体 101型担体 特点是 表面空隙小 比表面积大 机械强度高 担液能力强 表面有吸附中心 2 白色担体 6201型担体 特点是 表面空隙较大 比表面积较小 机械强度较差 担液能力中 表面无吸附中心 3 非硅藻土型担体 聚合氟塑料担体 玻璃微球担体 高分子微球担体等 特点是 表面空隙适中 比表面积适中 机械强度较强 耐高温 耐强腐蚀 价格偏高 硅藻土型担体用前要预处理 酸洗 碱洗 硅烷化 二 固定液的类型 三 固定液的极性 固定液与待测化合物之间的作用力主要属定向力 诱导力 色散力 氢键力等弱相互作用为主 所以固定相的极性对分离过程非常重要 固定相极性用相对极性P的公式表示 规定 氧二丙腈固定液的P 100 角鲨烷固定液的P 0 测试标样为环己烷 苯 按P的数值将固定液的极性以20间隔分为五级 0 20为0 1 称非极性固定液 20 40为 1 2 称弱极性固定液 40 60为 2 3 称中极性固定液 80 100为 4 5 称强极性固定液 固定液的极性与待测组分极性的选择原则为 1 按相似相溶原则选择 2 按组分性质的主要差别选择 四 固定液选择示例 2 5气相色谱检测器一 气相色谱检测器的类型气相色谱检测器根据响应原理的不同可分为浓度型检测器和质量型检测器两类 浓度型检测器 测量的是载气中某组分瞬间浓度的变化 即检测器的响应值和组分的瞬间浓度成正比 如热导池检测器 TCD 和电子捕获检测器 ECD 质量型检测器 测量的是载气中某组分质量比率的变化 即检测器的响应值和单位时间进入检测器的组分质量成正比 如氢火焰离子化检测器 FID 和火焰光度检测器 FPD 通用检测器有 1 热导池检测器 TCD Thermalconductivitydetector 测一般化合物和永久性气体2 氢火焰离子化检测器 FID Hydrogenflameionizationdetector 测一般有机化合物专用检测器有 3 电子俘获检测器 ECD Electroncapturedetector 测带强电负性原子的有机化合物4 火焰光度检测器 FPD Flamephotometricdetector 测含硫 含磷的有机化合物特殊检测器有 FTIR MS 测化合物结构 二 气相色谱检测器的工作原理 一 热导检测器 1 特点2 结构3 检测原理4 影响因素及注意事项 1 特点 浓度型检测器 优点 1 通用型 应用广泛2 结构简单3 稳定性好4 线性范围宽5 不破坏组分 可重新收集制备 缺点 与其他检测器比灵敏度稍低 因大多数组分与载气热导率差别不大 2 热导检测器的结构池体 一般用不锈钢制成 热敏元件 电阻率高 电阻温度系数大 且价廉易加工的钨丝制成 参考臂 仅允许纯载气通过 通常连接在进样装置之前 测量臂 需要携带被分离组分的载气流过 则连接在紧靠近分离柱出口处 3 检测原理 平衡电桥 右图 不同的气体有不同的热导系数 钨丝通电 加热与散热达到平衡后 两臂电阻值 R参 R测 R1 R2则 R参 R2 R测 R1无电压信号输出 记录仪走直线 基线 进样后 载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是纯载气 使测量臂的温度改变 引起电阻的变化 测量臂和参考臂的电阻值不等 产生电阻差 R参 R测则 R参 R2 R测 R1 这时电桥失去平衡 a b两端存在着电位差 有电压信号输出 信号与组分浓度相关 记录仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形 4 影响因素及注意事项 1 桥流 灵敏度 灵敏度足够时 桥流应尽可能小 100 200mA 先通载气 再给桥流 2 灵敏度 选 大的做载气 载 组 出正峰 载 组 不出峰 载 He N2 选氢气做载气 3 T池 池体与热丝温差 灵敏度 保证T检 T柱 以免造成检测器污染 4 热敏元件阻值的影响 5 浓度型检测器 A 1 u 以A定量 应保持u一定 峰面积定量依据 6 热导池的死体积大 灵敏度低 二 氢焰检测器 FID 1 特点2 结构3 检测原理和离子化机理4 操作条件选择和注意事项 1 特点 质量型检测器 优点 专属型检测器 只能测含C有机物 灵敏度高 TCD 响应快线性范围宽 缺点 燃烧会破坏离子原形 无法回收 制备纯物质 不采用 2 结构 1 在发射极和收集极之间加有一定的直流电压 100 300V 构成一个外加电场 2 氢焰检测器需要用到三种气体 N2 载气携带试样组分 H2 为燃气 空气 助燃气 使用时需要调整三者的比例关系 检测器灵敏度达到最佳 3 检测原理和离子化机理 检测原理 利用组分在氢焰中产生离子流进行检测有机化合物 离子对 离子流 流向阴 阳极 放大 记录 离子化机理 化学电离理论氢焰 自由基 正离子 1 当含有机物CnHm的载气由喷嘴喷出进入火焰时 在C层发生裂解反应产生自由基 CnHm CH 2 产生的自由基在D层火焰中与外面扩散进来的激发态原子氧或分子氧发生如下反应 CH O CHO e 3 生成的正离子CHO 与火焰中大量水分子碰撞而发生分子离子反应 CHO H2O H3O CO A区 预热区B层 点燃火焰C层 热裂解区 温度最高D层 反应区 4 化学电离产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定向运动而产生微电流 约10 6 10 14A 5 在一定范围内 微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比 所以氢焰检测器是质量型检测器 6 组分在氢焰中的电离效率很低 大约五十万分之一的碳原子被电离 7 离子电流信号输出到记录仪 得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线 A区 预热区B层 点燃火焰C层 热裂解区 温度最高D层 反应区 4 操作条件选择和注意事项 各种气体流速和配比的选择载气 N2气燃气 H2气助燃气 空气N2流速的选择主要考虑分离效能 N2 H2 1 1 1 1 5氢气 空气 1 10 极化电压正常极化电压选择在100 300V范围内 使用温度 80 200 高于柱温50 100 三 电子捕获检测器electroncapturedetector ECD 优点 高选择性检测器 仅对含有卤素 磷 硫 氧等元素的化合物有很高的灵敏度 检测下限10 14g mL 对大多数烃类没有响应 较多应用于农副产品 食品及环境中农药残留量的测定 四 其他检测器otherdetector 1 火焰光度检测器 flamephotometricdetector FPD 化合物中硫 磷在富氢火焰中被还原 激发后 辐射出400 526nm左右的光谱 可被检测 该检测器是对含硫 磷化合物的高选择性检测器 2 热离子检测器 thermionicdetector TID 氮 磷检测器 对氮 磷有高灵敏度 在FID检测器的喷嘴与收集极之间加一个含硅酸铷的玻璃球 含氮 磷化合物在受热分解时 受硅酸铷作用产生大量电子 信号强 3 定性检测器 联用仪器 将两种仪器结合 色 质联用仪 通过分子分离器连接 三 检测器的性能指标 理想的检测器应具有的条件 1 适合的灵敏度 对一些组分十分灵敏 而对其它则不 其间应相差达107倍 2 稳定 重现性好 3 线性范围宽 可达几个数量级 4 可在室温到400 下使用 5 响应时间短 且不受流速影响 6 可靠性好 使用方便 对无经验者来说足够安全 7 对所有待测物的响应相似或可以预测这种响应 8 选择性好 9 不破坏样品 但任何检测器都不可能同时满足上述所有要求 1 灵敏度S以一系列已知浓度或质量的组分对响应信号作图 得到校正曲线 该曲线的斜率k即为灵敏度S 实际工作中可从色谱图直接求得灵敏度 对于浓度型 Sc 灵敏度 mVmL mg A 峰面积 cm2 qvo 校正到检测器温度和大气压时的载气流量 mL min m 进样量 mg 对于质量型 Sm 灵敏度 mV s g m 进入检测器的样品量 g 2 检测限 D与通用的检测限表示方法相同 即注意 检测限不仅决定于灵敏度 而且受限于噪声 即检测限是衡量检测器或仪器性能的综合指标 3 最小检出量4 响应时间5 线性范围 2 6气相色谱定性法一 利用内标物与待测物的相对保留值r1 2进行定性分析 实验中要用双柱 或多柱进行分析 必须要有适当的标准物质 二 利用保留指数进行I进行定性分析 Xz 1 Xz分别代表含Z 1 Z个碳原子的正构烷烃在测定柱上的调整保留参数 Xi代表待测物质在测定柱上的调整保留参数 由于I的值温度之间呈线性关系 所以可以方便的外推求出文献测定条件下的I值而进行定性分析 无须标准物质 FigureSketchmapfordeterminationofrotentionindex 2 7气相色谱定量法一 色谱定量公式 mi fi Ai mi 待测物质质量 fi 待测物质定量校正因子 Ai 待测物质色谱峰的积分面积 二 色谱峰的面积求法 1 峰高乘半峰宽法2 峰高乘平均峰宽法3 峰高乘保留值法4 电子积分法 三 定量校正因子 Quantitativecalibration