转基因鱼研究进展.doc

沈文英(绍兴文理学院 生物系 ,浙江 绍兴 312000)摘 要 :综述了转基因鱼的研究进展 . 分别就基因转移技术 ,外源基因的整合 、表达和遗传以及应用前景等作了较为深入的讨论.关键词 :转基因鱼 ;基因转移技术 ;外源基因中图分类号 :Q789 Q785文献标识码 :A文章编号 :1008 - 293X(2000) 06 - 0100 - 04随着分子生物学 、遗传学和胚胎学的发展和相互渗透. 科学家利用重组 DNA 技术 ,将特定的目的基因从某一动物体分离出来 ,经扩增和加工导入另一动物早期胚胎细胞中 ,使其整合到宿主动物染色体上 ,在 动物的发育过程中表达 ,并稳定地遗传给后代 ,这种基因中稳定地整合有外源基因的动物称转基因动物( Transgenic animal) . 1985 年 ,我国学者朱作言率先研制出世界首例转基因鱼1. 随后 ,法国 、日本 、英国 、美 国和加拿大等相继开展了转基因鱼的研究. 转基因鱼的研究已成为鱼类基因工程研究的热点领域. 目前 ,转基因鱼的研究主要集中于促进鱼类的生长 、提高抗冻能力和耐低氧水平 、诱导发育基因的表达等方面.同时也对晶体蛋白基因 、卵黄蛋白原基因 (VG) 、氯霉素乙酰转移酶 ( CAT) 基因和色素基因等的转移做了基 础性的研究. 涉及的鱼类有鲤科 、鲑科 、胡鲇科 、鲷科 、鳅科 、狗鱼科等 .1研究背景1981 年 Costantini 将兔- 珠蛋白基因注入小鼠受精卵 , 表达出了- 珠蛋白21982 年 Palmiter 将大鼠生长激素重组 DNA 导入小鼠受体中 , 培育出具快速生长效应的超级鼠3. 这些工作证实了外源基因在受体中能正确表达并产生相应的生物功能. 同时预示着转基因方法党中央一 、从分子水平 、细胞水 平 、个体水平多层次 , 从发育时间和组织生理空间多角度立体地研究基因的功能和调控表达机制. 转基因动物的研究在基本理论和应用研究上都有重要的意义. 它可以为动物发育生物学研究和医学研究提供一条有效的途径和检测系统. 在实际应用上 , 使人类可能按照自己的意愿修正和改造物种 , 为家养动物 的定向育种创造条件. 也有可能建立微生物 、真核细胞以外的第三大克隆基因表达系统 , 即以大型动物为加工厂 , 大量合成和分泌贵重 、安全的医疗基因工程产品 , 如人胰岛素 、生长激素 、凝血因子4等 .鱼类是人类主要的蛋白质来源 , 具有重要的经济价值. 又鱼类具有怀卵量大 , 体外受精 , 体外发 育 , 胚胎操作简便 , 世代繁殖快 , 易于观察分析等特点. 更在于鱼类育种的单性发育技术渐趋成熟 , 为 培育遗传性状稳定的转基因动物新品系提供了哺乳类和鸟类等实验动物所缺乏的前提条件5. 因此鱼类是进行基因转移研究的较理想材料.2基因转移技术生产转基因动物的主要技术包括 :1 、外源目的基因的获得和组构. 2 、将外源目的基因有效地导入生殖细胞或胚胎干细胞 ,经过选择获得转目的基因的细胞. 3 、选择合适的体外培养体系和宿主动物 ,使转基因胚胎发育. 4 、鉴定 、筛选所得的转基因动物品系.转基因鱼外源目的基因的构建经历了 一个非全鱼基因到全鱼基因的过程. 即转基因鱼模型的构建经 历了一个非全鱼基因工程鱼到全鱼基因工程鱼的过程6. 如转生长激素 ( GH) 基因鱼的外源基因最初是人 收稿日期 :2000 - 03 - 30作者简介 :沈文英 , (1970 - ) ,女 ,浙江绍兴人 ,讲师 ,从事鱼类生理学研究.GH 基因 ,后来是大鼠 GH 基因 、牛 GH 基因 ,到最近普遍使用的是鲑科鱼类 GHcDNA. 使用的启动子最初是小鼠金属硫蛋白 (MT) 启动子 ,后来是劳斯肉瘤病毒 - 长末端重复序列 ( RSV - LTR) 、猿猴病毒 40 ( SV40) , 近来 使 用 winter flounder 抗 冻 蛋 白 ( AFP ) 基 因 启 动 子 , 野 鲤 MT 启 动 子 和 鲤 鱼 ( Cypri nus carpio haem atopterus) - 肌动蛋白基因启动子. 丘才良等将重组的 AFP 基因启动子与 Chinook Salmon GH 基因融 合导入虹鳟 ( S almo gai rdneri) ,获得的转基因个体经形态学和生物化学检测表明比对照鱼大 4 - 6 倍7. 鲤鱼基因工程育种研究中 ,将鲤鱼- 肌动蛋白基因启动子和草鱼 ( Ctenophary ngodon i dell us) GH 基因编码顺序构建成全鱼 GH 基因 ,通过转基因方法获得快速生长的转基因鲤鱼 ,其体重增长速度是对照鲤鱼的2 - 4 倍 . 鱼类营养学和能量学的研究发现 ,转基因鲤鱼的快速生长效应来自对饵料的高效转化和能量代 谢的优化分配 ,是真正意义上的快速生长6. 显示了全鱼基因 ,即全部基因元件均来自鱼类自身的重组基因的优势.外源基因导入受体细胞的方法有多种 ,主要有显微注射法 、电击法 、精子导入法 、脂质体融合法 、胚胎 干细胞移植法 、逆转录病毒感染法 、磷酸钙沉淀法 、微弹轰击和激光介导等方法 . 鱼类基因转移中主要采用前三种方法.显微注射法 在显微镜下 ,借助显微操作仪 ,将吸有外源基因的玻璃微针直接插入受精卵的原核中 , 注入目的基因 . 这是目前使用较广 ,效果较好的一种方法. 鱼卵受精后 ,用胰蛋白酶消化或机械方法去除卵 壳 ,得到裸卵. 裸卵的显微注射和以后的胚胎发育均须在无菌 Heltfreter 氏培养液中进行. 显微注射法的特点是可以准确地导入外源基因 ,外源基因在受体鱼中的整合效率较高 ,在 10 % - 50 %之间 ; 它不需载体 ,可直接转移目的基因 ,目的基因的长度可达 100 KB ,每卵可注射 106 外源基因拷贝 . 在转抗冻蛋白 (AFP) 基 因金鱼 ( Carassi us aurat us) 的操作中 ,甚至达 1010 拷贝8;它可以直接获得纯系 ,因此实验周期短. 但该方 法需要贵重仪器 ,操作技术难度大 ,注射外源基因的量不能精确控制 ;而且注射过程对鱼卵产生一定的机 械创伤. 因此只适用于卵壳较软 ,易于去除 ,对机械创伤有一定承受力的鱼类. 外源基因注射的时期一般为 单细胞期. 梁利群等研究发现 ,鲤鱼受精卵导入外源基因的最佳时期是单细胞后期至两细胞期. 在此发育 阶段易显微操作 ,孵化率高 ,整合率高 ,嵌和体比率低9.电击法 将卵直接浸泡在外源 DNA 溶液中 ,用一定强度的电脉冲处理 ,使外源 DNA 进入卵的动物 极 ,部分 DNA 拷贝可整合到受精卵基因组中. 这一方法操作简单 ,可同时处理大量的受精卵 . 但电脉冲处 理时 DNA 转移无定向性 ,转移效率低 ,其原因是外源基因无法通过绒毛膜和卵周隙 ,而难以达到细胞膜表面10. 因此该方法最好也在裸卵中进行. 谢岳峰用此法转移外源基因到泥鳅 ( Mis gurnus anguillicandat us )脱膜受精卵中 ,获得 10 %的转基因泥鳅11.精子导入法 精子在保存液中与外源 DNA 混合 ,经过一段时间的温育或电脉冲处理 ,外源 DNA 进入 精子细胞内 ,经过正常的受精过程 ,精子将外源 DNA 导入受精卵中. 该法较简单 ,方便 ,依靠生理受精过程 ,免去了对原核的损伤. 但其受精受细胞受精能力的限制. 用质粒 PUSVCAT 温育斑马鱼 Pterois volit ans精子并使其与卵受精 ,获得 23 - 37 %的转基因鱼 ,并获得转基因子一代和子二代12.鱼类怀卵量大 ,体外受精 ,体外发育. 鱼类的胚胎发育速度和哺乳动物胚胎发育相比要快几倍 、甚至几 十倍. 鲫鱼受精卵第一次卵裂需 45 - 50 分钟 (20 ) ,后来的细胞分裂时间更加短暂. 鱼类胚胎细胞核在胚 胎发育过程中频繁地解体和重建 ,外源基因在此期间持续复制和扩增 ,并整合到受体基因组中5. 建立代 的胚胎经 DNA 分子杂交鉴定 ,确定是否为转基因鱼. 通过对 DNA 、mRNA 、表达产物及表达产物效能的分 析 ,可筛选出转基因的子一代和子二代. 转 GH 基因的鲤鱼13,虹鳟7,大西洋鲑14,均出现快速生长效应 . 转 AFP 基因的大西洋鲑表达的 AFP 水平低 ,不足以抗冻保护15.3外源基因的表达和遗传外源基因导入受精卵后 ,在胚胎发育早期即原肠胚形成期进行大量的复制和扩增 ,DNA 分子以串联的方式连接成多聚体. 在斑马鱼中外源基因扩增 10 倍 ,在鲤 、鲫 ( Carassi us aurat us aurat us) 、泥鳅中扩增100 倍 ,在青鱼将 ( Poecili a l atipi nna) 中扩增 103 - 105 倍 . 到原肠后期 ,外源基因逐渐被降解或丢失 ,只有少因鱼胚胎的发育产生不同的影响 ,表现为三种整合形式 : (1) 有效整合 ,即整合的外源基因完整 ,且具有合适的整合位点和方向 ,并能正确表达 . (2) 无效整合或沉默表达 ,即无表达作用的整合. (3) 毒性整合 ,即整 合的外源基因扰乱了受体管家基因和主要旺势基因的表达 ,造成鱼体生长发育受阻 ,畸形甚至死亡. 只有不扰乱管家基因和发育阶段表达的旺势基因的结构和功能的整合 ,才能使受体鱼类正常发育5. 每个受体基因组整合 1 至多个外源 DNA 分子. 在转珠蛋白基因虹鳟子代中达 50 拷贝 ,在斑马鱼种系中达 100 拷贝. 由于外源基因整合的随机性和多样性 ,转基因鱼很可能是外源基因的嵌合体 ,也即只有在某些组织或鱼体 某些结构组分中带有外源基因 ,而在另一部分组织中则无外源基因13. 整合在性腺细胞基因组中的外源 基因则可通过生殖细胞传递 ,获得遗传性状16.表 1外源基因的表达种外源基因拷贝龄增重或表达水平 ( %)研究者年份转 GH 基因大西洋鲑 (全鱼基因工程鱼) 鲤鱼(全鱼基因工程鱼)泥鳅转 AFP 基因 大西洋鲑1061 年400 - 600最大 130037. 5Hew ,C. L .Du Shaojun 沈俊宝 孙孝文 朱作言199210690 天1993106135 天300 - 46019861062 年40Fletcher , G1992 130 天40 由表 1 可以看出 ,全鱼基因工程鱼的生长速度明显加快. 其原因有几个方面 : 一是应用了同源的 GH基因 ,能更好地被 GH 受体识别 ;二是 winter flounder 抗冻蛋白 (AFP) 基因启动子具有组织专一性 ,使外源基 因在肝脏中优先表达 ,并使其与肝细胞膜上的 GH 受体有效结合发生作用 . 既使外源基因的表达水平很 低 ,也可以诱导类胰岛素生长因子 ( IGF - 1) 的表达 ,刺激外周组织的生长7.转基因鱼可以将所携带的外源基因通过有性过程传递给子代 ,但无论采用哪一种基因转移方法 ,外源 基因在转基因鱼基因组中都不能进行定点整合. 由于是随机整合 ,转基因鱼远非一个稳定的遗传体系 . 多 数情况下 ,外源基因尚未稳定地传递到子二代. 转基因鱼的子三代尚未见报道. 转人 GH 激素基因的鲤鱼 , 在其子一代和子二代的检出率分别为 45 . 3 %和 66 . 7 % ,外源基因在转基因鱼子代中可表达具生物功能的 产物人 GH 激素 ,并能促进鱼的生长13. 转 GH 基因的虹鳟子一代和子二代的转基因频率分别为 10 - 20 % 和 71 . 5 %16. 转抗冻蛋白基因的大西洋鲑 ( S almo s al ar) ,虽已获得第二代 ,但表达的抗冻蛋白水平低 ,不 足以抗冻保护 ,还需加强启动子或增加 AFP 基因剂量15. 外源基因的遗传 ,虽有证据证明符合孟德尔定 律 ,但由于建立代中普遍存在镶嵌现象 ,子代中外源基因的携带率就明显低于理论值 50 %或 75 %13. 外 源基因的遗传有待于进一步的研究.表 2外源基因的遗传子 一 代子 二 代种研究者年份转基因频率 增重转基因频率( %)增重( %)( %)( %)转 GH 基因大西洋鲑 (全鱼工程基因鱼) 镜鲤虹鳟转 CAT 基因 斑马鱼转 AFP 基因 大西洋鲑10平均 520Hew ,C. L . ,Du Shaojun朱作言等Guyomard ,R.19925010 - 20最大 7701989198971. 52050Stuart , G. W.19881550Fletcher , G. L .19924前景与展望转基因鱼的研究为鱼类基因工程育种奠定了理论基础. 基因工程育种从根本上摆脱了物种遗传壁垒和有限育种资源的限制. 通过对鱼类基因组的定向改造 ,可以获得高产 、优质 、抗逆的鱼类养殖新品系 . 为水产养殖业提供理想的养殖对象. 目前 ,基因定点整合技术已成功应用于哺乳类细胞的基因组改造 ,但在 鱼类外源基因还不能进行定点整合 ,因此需要建立鱼类细胞基因定点整合技术 ,实现外源基因在鱼类细胞基因组中的稳定整合. 转基因鱼必将成为基因功能研究的理想材料 . 由于鱼类生物发育学的特点 ,转基因鱼模型有利于胚胎发育相关基因功能的研究和人类疾病模型的研究 . 转基因哺乳动物的乳腺生物反应器 已为生物医药产业开辟了一条新途径17. 通过基因组的定点改造和修饰 ,转基因鱼也可高效表达目的基 因产物或合成相关代谢产物 ,并在鱼体特定组织中累积 ,成为高效的生物反应器 ,生产廉价的贵重蛋白质和生物药物. 为人类健康事业作出贡献 .参考文献 :12345678910Zhu ,Z. ,et al . . Angew. Z. IchthyolJ . 1985 ,1 :32 - 34.Costantini ,F. ,Lacy , E. . Introdution of a rabbit- globin gene into the mouse germ lineJ . Nature ,1981 ,294 :92 - 94. Palmiter ,R. D. and Brinster ,R. L . . Germ - line transformation of micJ . Am. Rev. 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