L05081郑斌

项目类别项目批准号BL05081 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称： 固定化绿色木霉产纤维素酶的研究 申 请 人： 郑斌 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 02级生物技术 联系电话：指导教师: 高向阳 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 一 日 结题日期： 二六 年 四 月 一 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称固定化绿色木霉产纤维素酶的研究项目类别B、理科类申请经费1500元起止年月2005.42006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字郑斌男1982.112002级生物技术3班生命科学学院70.73全面研究姓名高向阳性别女学位博士职称副教授研究方向酶工程、生物制药授课名称生物化学、酶工程、生物分离技术项目简介纤维素是地球上最丰富、最庞大且可更新的资源之一，与人类的生存有密切的关系。纤维素是一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，它在纤维素酶的作用下,可降解为低聚纤维素及糖。纤维素转化为葡萄糖是人们利用它的主要形式，而微生物是纤维素酶的主要来源。本项目研究的主要内容是采用物理吸附法固定化绿色木霉，在此基础上找出最佳的发酵条件，提高纤维素酶的产量。菌丝体细胞的固定化是通过菌丝体球与海绵的惯性碰撞作用，进而将菌丝体截留在海绵内部孔隙来实现的。选用合适孔径的海绵把细胞吸附，这既可以避免传质扩散时受到阻力，又可以避免在循环培养器中因海绵间摩擦而导致细胞脱落。同时也可以使菌丝体在一个相对更稳定的环境中产有效成分。尽可能减少外部条件对其的影响，从而达到增产的目的。本项目通过考察了摇床转速、表面活性剂、培养液初始pH值、不同吸附物质与海绵数量五个方面对绿色木菌固定化效果的影响。从实验中得出最佳的发酵条件为：将0.4g海绵装于装有50mL液体培养基（初始pH值为6左右）的250mL的三角瓶中，适当的接种量。放入摇床（24 28 120 r/min），培养的 3 d，菌丝体开始在海绵内外生长同时培养液开始变浑浊。后将吸附海绵转至50mL发酵培养液的250mL三角瓶中（初始pH值为6左右），并添加1%吐温-80再以摇床转速180转/min，在24 28，进行培养，当第8d时产酶到达最高峰。通过优化最佳的发酵条件，找出一条适合实际生产的路线，提高纤维素酶的产量，降低生产成本，提高企业的经济效益。二、项目研究的内容与方法（一）技术路线 固定化菌丝体细胞 载体处理 固定化细胞 发酵 发酵物测定（二）材料与方法1、材料材料：经过紫外光和亚硝酸诱变的绿色木霉（Trichodrema vivide），为实验室保存菌种。载体海绵，孔径0.7mm0.9mm、多孔陶瓷 由广东省佛山陶瓷研究所提供。试剂与设备：试剂：0.05mol/L的HCl0.1mol/L的NaOH0.50%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)：精确称取5.1gCMC-Na，加入适量0.05mol/L、pH值5.0柠檬酸缓冲液，加热溶解后定容至1000 mL，用前充分摇匀。3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸钾钠的热溶液(192g酒石酸钾钠溶于500mL水中)，在加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中。pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.05mol/L):加柠檬酸4.3g与柠檬酸钠8.67g混合，加蒸馏水定容至1000 mL。用具：培养皿、250mL三角瓶、试管、玻棒、烧杯、量筒100mL 设备：电子称量器、高压蒸汽灭菌锅、沙布、棉塞、棉绳、牛皮纸、烘箱、恒温培养箱、恒温摇床培养箱、紫外分光光度计2、方法培养基配制营养液：KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.4g，MgSO47H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，FeSO47H2O 5.0mg，MnSO4H2O 1.56mg，ZnSO47H2O 1.4mg，CoCl2 2.0mg，蒸馏水定容至1000毫升，调节pH为5.8。固体培养基：营养液30g/L琼脂20g/L葡萄糖 pH5.8液体发酵培养基：营养液0.01mg/mL 葡萄糖0.01g/mL 粗纸巾纸浆 pH5.8绿色木霉的固定及培养的方法A、绿色木霉的培养与固定在无菌室或无菌箱中接种菌丝体于斜面培养基中。把接种好的培养基放入24 28 培养箱培养13d。将一定体积的培养基置于锥形瓶中,经灭菌、冷却后,将取有菌种的接种环伸入液体培养基使环在液体表面与管壁接踵的部分轻轻摩擦.接种后塞好棉塞,将试管轻轻摇动,是菌体在培养液中分散开来。 同时放入适量的已经高温灭菌处理过吸附物（多孔陶瓷或者海绵），在用棉花塞和牛皮纸密封住瓶口。放入摇床, 在24 28 120 r/min 条件下培养13d。B、绿色木霉的发酵在无菌室中将已吸附好菌丝体的吸附物取出放入装有50mL发酵培养液的250mL三角锥形瓶，在用棉花塞和牛皮纸密封住瓶口，放入摇床, 在24 28 180 r/min 条件下培养若干天。C、纤维素酶活的测定 每隔24h用移液枪从发酵培养液中吸取3mL的液体，用低速离心机3000r/min离心培养液5min，弃去沉淀，取上清液。然后进行上述所讲的方法的测定。并记录数据。分析方法A、纤维素酶活性测定方法取0.6mLCMC-Na溶液加到试管中，50水浴锅里预热510min，然后加0.2mL酶液振荡摇匀放在50水浴锅保温反应30min。反应后加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色液0.6mL摇匀，置于沸水浴5min。冷却至室温，加蒸馏水3.6mL，在光波长540nm下测定A540nm值，查表得葡萄糖含量。本实验以在50下，每小时由底物生成1mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U) 葡萄糖含量(mg) 酶液定容体积(mL) 5.56酶活力(U)= 反应液中酶液加入量(mL) 反应时间(h)式中 5.56：为1mg葡萄糖的物质的量(mol)，而其他参数的值根据酶活力的测定方法分别是：反应液中酶液加入量0.2mL，反应时间0.5h。得到酶活力计算的简化式如下：酶活力(U)=葡萄糖含量(mg) 酶液定容体积(mL) 55.6mol mL-1h-1B、葡萄糖标准曲线的制作方法每管加入0.6mLDNS，置于沸水浴5min。冷却后，各管分别加入蒸馏水3.6mL至终体积为5mL，然后在波长540nm下比色测定光吸收值A540nm，用1号管溶液调零点。以吸光值A540nm为 坐标，以葡萄糖含量为纵坐标，作出标准曲线。如图2。 图2 葡萄糖标准曲线三、项目研究过程与资料查阅情况(一)、研究内容1、不同摇床转速对产酶的影响将0.4g海绵装于装有50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，适当的接种量。放入24 28 以120 r/min摇床培养的 3 d，菌丝体开始在海绵内外生长,同时培养液开始变浑浊。后将吸附海绵转至50mL发酵培养液的250mL三角瓶中，再设定摇床不同转速（120、150、180和200 r /min），在24 28，进行培养。每隔 24h测定纤维素酶的活性，其变化见表3。表3 不同摇床转速对产酶的影响DAY吸光值A540nm(120转/min)酶活力（U/g）吸光值A540nm(150转/min)酶活力（U/g）吸光值A540nm(180转/min)酶活力（U/g）10.0252.110.0302.530.0453.7920.0332.780.0544.550.0746.2430.0494.130.0726.070.1159.6940.0645.390.0927.780.14011.8050.0736.170.1089.120.15813.3260.0887.420.12210.280.17915.0970.0927.750.13611.460.20217.0380.0978.180.14312.090.20617.3690.0998.340.14912.650.19616.52当摇床设定转速为200 r /min时，由于转速过快，导致很多已吸附在海绵上的菌丝体被甩到发酵液中，过2d后，由于生长速度过快，发酵液中长满很多直径较大球状菌丝体,其酶活到达最高峰，到了第3d酶活已经开始大幅度的降低，第5d酶活已经基本为0。可能是由于生长过快，导致养分跟不上生长的需要，很多菌丝体开始自溶。可以看出200 r /min不适合于固定化的发酵生长。当摇床的转速为120180 r /min时，随着转速的提高，酶活也随之提高，与转速成正比。从上述可以得出180 r /min是最适合固定化的发酵。2、表面活性剂对产酶的影响表面活性剂能提高细胞的通透性，有利于纤维素酶排出。吐温-80是常用的一种表面活性剂。以浓度为1%吐温-80和不加吐温-80的培养剂产酶结果如下图。在前两天不加吐温的酶活比较高，但到了第三天以后，加了吐温的培养基酶活比没有加入吐温的培养基活力高出很多。其中的原因很显然是表面活性剂改变细胞膜的透性，使其产生更多的胞外纤维素酶。但是前两天加入表面活性剂的酶活低的原因很可能是霉菌还没有适应新的环境而导致其生成代谢的缓慢，从而减少胞外酶的排放。图4 TW80对产纤维素酶的影响3、培养液初始pH值对产酶的影响分别在初始pH为4、5、6和7的摇瓶培养液(50mL培养液于250mL的三角瓶中)中进行产酶培养，测定其产酶的结果如表7所示。在酸性条件下产酶较在中性条件下高，且中性条件下产酶效果极差。可以看出此酶更适合在酸性条件下生长。从图7中可以很明显的看出在pH等于6时产酶的效果是最好的，pH 等于5次之，pH等于4最差 ，可以得出结论，在培养基的初始pH值为6左右为宜。图7培养液初始pH值对产酶的影响4、不同吸附物质对产酶的影响将0.4g海绵装、0.6g多孔陶瓷于装有50mL液体培养基的250mL的三角瓶中，适当的接种量。放入24 28 以120 r/min摇床培养的 3 d，菌丝体开始在海绵内外生长，同时培养液开始变浑浊。后将吸附海绵转至50mL发酵培养液的250mL三角瓶中，再以转速180r/min，在24 28，进行培养。每隔 24h测定纤维素酶的活性，（以游离态为对照）其变化见图8。图8 不同吸附物质对产酶的影响从图8可以看出用0.4g海绵进行菌丝体吸附，其产酶的效果最好，增长比较平稳且高产。虽多孔陶瓷其吸附能力更强，但是在实验过程中发现到其的缺陷有五点：一、其通气性较差，吸附在内部的菌丝体很难得到氧气；二、产酶不稳定，从表中可以得知。三、其回收较难，要用强酸或强碱浸泡很多天才能溶解掉吸附在其上的菌丝体；四、发酵过程中，发酵瓶底部随时间的推移出现越来越多的白色粉末，经鉴定为多孔陶瓷的粉末，应该是在由于在摇转的过程中，于玻璃瓶壁相摩擦而导致粉末的产生。五、多孔陶瓷的价格贵还需特制，并不适合大规模生产。海绵价格便宜，且来源广泛，适合大规模的生产需要。根据上述图表所得出的性质：用海绵所产酶稳定高产。所以海绵是最适合用于固定化发酵的吸附物质。5、海绵数量对产酶的影响分别放置0.2 g、0.4g与 0.6g海绵于液体培养基(50mL培养液于250mL的三角瓶中)中，相同的接种量。放入摇床（24 28 120 r/min），培养的 3d，菌丝体开始在海绵内外生长同时培养液开始变浑浊。后将吸附海绵转至发酵培养液(50mL培养液于250mL的三角瓶中)中，再摇床上培养（24 28 180 r/min）进行培养。每隔 24h测定纤维素酶的活性，其变化见图9。图9 海绵数量对产酶的影响由图9可以看出0.4g海绵的产酶活性最高，在第8天达到产酶的最高水平。而0.6g海绵产酶略低于0.4g海绵，可能是由于白色曲霉是好氧真菌，过多的海绵影响其通氧效果，而导致产酶效果的降低。而0.2g海绵由于吸附菌体数量较少，而影响了其产酶效果。从中可以得出0.4g海绵/50mL发酵液的效果最好。(二)资料查阅情况1吴文能.2004.绿色木霉H1B纤维素酶的分离纯化及其部分性质的测定.华南农业大学本科论文2邢小黑，孔小龙.香菇的海绵固定化培养研究，食用菌，2002.（1），893孙亦阳. 姬松茸的海绵固定化培养研究. 广州食品工业科技.20(4,总 82)4王亚林,严建芳.表面活性剂对木霉菌产纤维素酶的影响. 生物技术. 12(3)5 单谷，罗廉，余世袁.值对纤维素酶制备的影响.南京林业大学学报. 1999. 23(3)6栗学俐，贺飞.纤维素酶水解纤维素还原糖的测定.湖北化工，1999.:43-447 管斌，丁友昉，谢来苏,等.还原糖测定方法的规范.无锡轻工大学学报，1999.18(3)：74-788 汪维云，朱金华，吴守一.纤维素科学及纤维素酶的研究进展.江苏理工大学学报. 1998. 19(3)：20-289 栗学俐，贺飞.纤维素酶水解纤维素还原糖的测定.湖北化工，1999. (1)：43-4410微生物诱变育种编写组.微生物诱变育种.北京：科学出版社.1973四、项目成果完成形式和价值从本次项目的研究可以得出产纤维素酶的最佳的发酵条件为：将0.4g海绵装于装有50mL液体培养基（初始pH值为6左右）的250mL的三角瓶中，适当的接种量。放入摇床（24 28 120 r/min），培养的 3d，菌丝体开始在海绵内外生长，同时培养液开始变浑浊。后将吸附海绵转至50mL发酵培养液的250mL三角瓶中（初始pH值为6左右），并添加1%吐温-80再以摇床转速180转/min，在24 28，进行培养，当第8d时产酶到达最高峰。 采用可循环再用的海绵作为固定化载体，原料来源广阔，成本小，收益大，固定化效率高，而且对环境不造成污染。再则是可以便快捷的进行多次生产，节约材料成本（把发酵液中的有效成分提取后还能再次用于生产），减少劳动成本（不需要投入大量的工人，只需要较少量的工人更换其发酵液），降低生产成本，提高经济效益，为进行扩大生产，降低生产成本创造了有利的条件。五、经费使用情况实验材料费：1000元试剂费：200元检测费：100元其它（易耗品等）：200元共计：1500元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结在进行项目之前，必须查阅相关资料，