百日咳杆菌毒素.doc

百日咳杆菌毒素自从1909年发现百日咳杆菌对热不稳定毒素（heat-labile toxin, HLT）或称皮肤坏死毒素后，百日咳杆菌的活性物质不断被分离和提纯，其中与致病有关的物质陆续被发现。与百日咳杆菌致病有关的物质除荚膜外，尚有百日咳杆菌的菌毛成分、内毒素（endotoxin）、百日咳毒素（pertussis toxin, PT）和腺苷酸环化酶/溶血毒素（adenylate cyclase/hemolysin toxin, ACT）等：内毒素即百日咳杆菌脂多糖（LPS）；百日咳毒素由于其多重作用而有不同的命名，如因能提高小鼠对组织胺、5-羟色胺等的敏感性而被称作组织胺敏感因子（histamine-sensitizing factor, HSF），因能促进白细胞、淋巴细胞增生又被称作白细胞增生因子或称淋巴细胞增生因子（leukocytosis promoting factor, LPF），因能使百日咳杆菌粘附于呼吸道纤毛上而使细胞损伤导致阵发性咳嗽又被称作气管细胞毒素（tracheal cytotoxin, TCT）；ACT能促进巨噬细胞内的cAMP增加而抑制巨噬细胞功能，而且此环化酶毒素又能活化胰岛B细胞导致大量胰岛素分泌而有被称作胰岛素活化蛋白（islets-activating protein, IAP）；百日咳杆菌有菌毛血凝素（fimbrial hemagglutinin, FHA）和白细胞增生因子-血凝素（lymphocytosis-promoting factor hemagglutinin, LPF-HA），使病人淋巴细胞增多，两者对小鼠均有免疫保护活性。近年对百日咳杆菌的研究热点主要集中在调控百日咳毒素表达的天然启动子和百日咳疫苗的研制上。现将起主要毒素及疫苗的研究进展分述如下。一. 内毒素(1-3)百日咳杆菌脂多糖又称耐热毒素，是百日咳杆菌的被膜成分。与其他细菌的内毒素同样，其介导活性的主要部分为LPS的类脂A（lipid A）结构。1. 化学性质 早期采用热酚/水法提取百日咳杆菌的LPS（Westphal et al, 1952），以后有人用超速离心进行纯化并用各种蛋白酶处理以得到高纯度的LPS，各种不同菌株获得的LPS产量为634mg/g细菌干重。百日咳杆菌内毒素的主要特征是含有两种不同成分的LPS，分别称作LPS-和LPS-。LPS-和LPS-两者比例为2：3。两组分均存在于百日咳相菌和部分相菌。这两组分的差别在于分子的类脂部分不同，一种分子的类脂连着2-3个脂肪酸而另一种含有3-5个脂肪酸，而且脂肪酸的组成也较特殊，含有罕见的2-甲基-3-羟基葵酸和2-甲基-2-羟基四葵酸，其他的成分如磷酸盐、葡萄糖胺、四葵酸、3-羟基四葵酸和3-羟基葵酸大致一致。类脂部分与多糖以3-脱氧-2-辛酮糖酸（KDO）分子相连，但KDO分子在两种LPS中磷酸化程度不同。将百日咳杆菌LPS用4mol/L HCl在100水解，得到一种含分支的三糖，即4-O-（2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖基）-6-O-（2-氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖基尿嘧啶）-D-吡喃葡萄糖。此分子皆存在于两种LPS中。用质谱法精确测定百日咳杆菌LPS的类脂部分的分子量，结合31P-NMR的结果推断的百日咳杆菌类脂A的结构见图1。2. 百日咳杆菌LPS的毒性 百日咳杆菌LPS具有明显的致热原性、Shwartzman反应、佐剂活性并具有增强对感染的非特异抵抗力活性等，现将百日咳杆菌LPS的活性小结于表1。表1 百日咳杆菌LPS的生物学活性试验方法结果小鼠体重增长试验（18-20g小鼠）注射24h，体重改变的最大剂量为1.07g家兔热原性试验2g/kg剂量，最大平均升高温度为2家兔局部Shwartzman反应阳性反应的敏感剂量介于12.5-200g保护反应：诱导小鼠对伤寒、大肠杆菌、肺双、绿脓杆菌和金葡菌感染的非特异性抵抗力（LPS和各菌攻击，相隔3天）LPS剂量在12.5-200g，对所有攻击菌具有显著保护作用，最大保护作用是对肺双，最弱保护作用是对绿脓佐剂作用：在流感病毒疫苗对小鼠的佐剂活性抗病毒血凝素抗体年度增高2.5倍二对热不稳定毒素(4)百日咳杆菌培养于合适的固体或液体培养基中，从陈旧培养基的上清液或新鲜收集的百日咳杆菌破碎后离心所得的上清即可得到HLT。1 HLT的理化性质 在不同型分离得到的HLT含量和毒性不一，光滑型新分离培养物含有较大量毒素，而小菌落变种具有高度毒性。从新鲜细菌破碎提取的HLT毒性较强。提取的流程如下：6% NaCl洗下培养于马铃薯甘油血培养基的百日咳杆菌35干燥3天与NaCl结晶混合磨成粉高速离心DEAE-纤维素吸附，在pH值7.1下0-1mol/L NaCl梯度洗脱硫酸铵盐析活性组分再溶即得到高度纯化的HLT纯化的HLT为蛋白质，存在于细菌的细胞壁，超速离心在1.4S，分子量约为89Kd，含14.6%的氮和1.4%还原糖，无脂类和磷酸根，能被胰蛋白酶消化，但不被DNA酶或RNA酶消化。纯化的HLT最小致死量为6-10g/小鼠，对豚鼠的最小皮肤坏死剂量为0.01g 。HLT在5-22保存于水溶液两天，活性就尚失25%，37两天或409小时95%的毒性消失，因此称作对热不稳定毒素。利用这一性质，可以在37用0.3%的福尔马林脱毒制备类毒素。干燥的HLT的毒性相对较稳定，保存于50%葡萄糖或蔗糖也可保持稳定性，但碱性有利于毒素的破坏。2. HLT的毒性与致病性 HLT为一种高度毒性蛋白，其毒性在体内及体外均可损伤各种组织，能引起气管和支气管纤毛上皮细胞炎症和坏死，在百日咳致病上具有重要意义。用纯化的HLT给豚鼠和小鼠腹腔或静脉内注射，肝脏、脾脏和肾脏出现明显坏死、充血、出血和退行性变。将粗提的HLT感染绵羊、猪和鸡，也引起皮肤坏死，其毒性反应和家兔与豚鼠试验相似。典型者，当小鼠注入HLT后，脾脏苍白和明显萎缩，在7天内脾脏平均重量自51mg降至13mg，组织学检查末发现红髓，仅有少许脾小体，在小体之间空隙充满结缔组织，淋巴细胞大量减少，肝脏的重量也减少并出现轻度细胞萎缩，腹腔伴有腹水。HLT能直接作用于呼吸中枢，提高吸气和呼气反射中枢的兴奋性。HLT对体外培养组织细胞有杀伤作用，如HeLa细胞、鸡胚肺上皮细胞、原代鼠胚及KB细胞具有杀伤作用。HLT对神经组织的作用表现在：注射少量毒素于豚鼠、小猫或小狗脑内或脑膜中，引起动物惊厥和大脑损伤的症状，豚鼠通常在5-24小时内死亡。典型的组织学变化是：脑细胞发生水肿，脑膜血管周围、神经组织和脑室等都有白细胞浸润，细胞核变化，胞浆颗粒性物质减少和空泡形成。3. HLT的免疫性 先前认为HLT无抗原性，后来证实HLT粗制品经福尔马林脱毒后，能使儿童和实验动物产生抗体，该抗体能中和HLT皮肤坏死作用和致死活性。HLT不易在体内显示抗原性的原因可能是HLT为弱抗原性，容易在动物体内被破坏，尤其脾或淋巴结阻止毒性作用不能刺激抗体产生，且HLT与菌细胞浆内结合，致使不能很好刺激机体产生抗体，如用类毒素，则能刺激机体产生抗体。用HLT抗毒素能保护小鼠腹腔内百日咳杆菌的攻击，而免死于毒血症；抗毒素对鼻内攻击百日咳杆菌而至的动物肺部感染也有保护作用；但用百日咳杆菌攻击小鼠脑内则无保护作用。这些结果致使百日咳杆菌HLT的保护性抗原研究尚未得出定论，但大多数人认为百日咳的抗度免疫极为重要，在制备疫苗苗时应该含有HLT类毒素。三. 百日咳毒素（PT）(5-14)由于以前提取和制备的差别以及百日咳毒素的多种生物学活性，致使百日咳毒素有许多别名。现在从基因的角度已经清楚，百日咳毒素是6个亚基组成的蛋白复合物，但只有5个亚单位，即S1、S2、S3、S4、S5之间的比例为1：1：1：2：1而形成6个亚基的复合物，分子量为105Kd。1. PT的制备与纯化 PT在先前用不同的纯化方法得到后，在某方面观察到效果而被命名为不同的名称。这里介绍Munoz等（1981）的方法，这一方法相比较而言得到较纯的PT，而其他的方法要么太粗或者把6个亚基给将解了。将百日咳杆菌培养于Stainer和Scholte综合液体培养基中，经36孵育5天，除去菌细胞的上清液用冰醋酸调pH至6.5，然后每升中加入0.5g/ml的ZnCl2 20 ml，离心收集沉淀物，按上清也量每升加入10%Na2HPO4溶液37ml，使Zn-蛋白复合物溶解，离心取沉淀，用50mmol/L的Tris-HCl NaCl缓冲液pH8.0（TNB）37ml抽提两次以上，混合抽提液，以5mmol/L Tris-HCl pH8.0 16ml连续透析3次，进一步离心收集沉淀物，再以0.1mol/L焦磷酸钠pH10.5提取，其抽提物再以低pH的TNB等容积稀释，未溶的沉淀物再按上述方法提取两次以上。将此含有PT的抽提物进行Sepharose CL-6B（2.590cm）层析，收集各组分，真空超速离心，所得的活性部分在通过生物凝胶-A0.5M过柱，过柱的活性部分混合在离心浓缩，置2-5经2-3周，PT结晶。2. PT的活性 以上述结晶的PT给CFW小鼠腹腔所得到的活性如表2。表2 PT注射CFW小鼠后的主要活性血凝反应5300U/mg组织胺致敏0.5ng（50%致敏剂量）增高胰岛素浓度2ng增高血管渗透性0.5ng增高抗体应答0.1ng白细胞增生作用8-40ng毒性反应（小鼠腹腔）546ng超急性实验性过敏性脑脊髓炎（Lewis大鼠）20ng在观察PT所致的炎症反应时，Munoz等（1984）用PT与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别注射小鼠，结果发现：当小鼠足垫注入福氏完全佐剂和静脉注入PT后，足垫炎症反应发展显著，而不注入PT的小鼠足垫肿胀不明显。上述结果提示PT能显著增强福氏佐剂引起的炎症反应，重要有单核细胞浸润。同年他们发现小鼠实验性过敏性脑脊髓炎的发生可由于PT的作用而加强。PT能诱导低蛋白血症和增高皮肤和骨骼肌毛细血管渗透性。小鼠静注PT后，在第一天和第十天采血，正常小鼠血浆蛋白浓度为6.020.06g/100ml，而试验鼠为5.190.07g/100ml。血浆蛋白减低的主要是白蛋白，可能与PT使皮肤血管渗透性增高和骨骼肌血管渗透性增高所致。3. PT的免疫性与致病性 现在基本已确认PT是百日咳杆菌最重要的毒力因子。早期的实验已经证实（Vogel等，1985）：PT在百日咳杆菌感染早期可抑制免疫应答，可认为它是通过免疫抑制机理即阻碍初次抗体（IgM）应答，有利于病菌的感染和发展。初次抗体应答的抑制是由PT刺激Lyt2+淋巴细胞（抑制性/细胞毒性淋巴细胞），特别是Ts淋巴细胞增殖的结果。同时，PT是T细胞的丝裂原，抗体应答被抑制可能是PT刺激Lyt2+淋巴细胞诱生一种可溶性抑制因子（淋巴因子）-干扰素。后来许多学者都证实了这一实验。四. 百日咳疫苗研究进展(15-19)近年来的临床研究已经证明包含不同组分，如PT、FHA和菌毛等的无菌疫苗能够保护世界卫生组织（WHO）所定义的百日咳。从临床试验和对儿童的接种的结果来看，这种无菌疫苗的安全性优于传统的全菌疫苗。下表是在儿童接种全菌或无菌疫苗后的效果比较。表3 儿童接种全菌和无菌疫苗后的比较疫苗名称抗原组成*（g）开展临床研究的国家估计的有效率（%）CLI Pw全菌意大利/瑞典36/48PM Pw全菌塞内加尔96W Pw全菌英国93-94SB Pa2PTd (25), FHA (25)瑞典59SB Pa3PTd (25), FHA (25), PRN (8)意大利84CLL Pa5PTd (25), FHA (25), PRN (3), 菌毛2,3 (5)瑞典85PM Pa2PTd (25), FHA (25)塞内加尔85CB Pa3重组PT (5), FHA (2.5), PRN (2.5)意大利84*抗原包括化学脱毒的PT（PTd），基因工程突变脱毒的PT（rPT），百日咳活性素（pertactin, PRN），丝状凝集素（filamentous hemagglutinin，FHA），菌毛2型和3型（fim2，3） 这可能主要是因为百日咳全菌疫苗接种后常引起局部和全身反应，但多数在接种部位出现一时性热、红、肿、痛；主要的全身反应为发热和容易兴奋。Barkin等（1979年）对美国使用白、百、破三联疫苗（DPT）进行调查研究，根据记录统计，婴儿无反应者占7%，而轻反应者占27%，中反应者占59%。Baraff等（1979年）比较DPT疫苗和白、破二联疫苗（DT）对机体的不同反应，结果DPT引起接种局部红肿反应占51%，而DT则为17%，说明百日咳杆菌是引起局部反应的主要成分，但非为唯一的成分。 早在1933年Madsen业已报导，注射百日咳菌苗后出现第一例脑病变死亡，以后陆续也有发现此种严重中枢神经严重反应，但仍然是个别的特发病例，多数可出现惊厥、休克等症状，可能与百日咳原和内毒素的性质相关，也可能百日咳杆菌具有神经毒素。有惊厥史的婴幼儿，一般情况下应推迟接种DPT。 Honnik等（1979年）指出给儿童正常剂量百日咳菌苗后，血浆胰岛素浓度一时性升高，儿童出现的反应可能由于不适当保持（inadequate maintenance）葡萄糖的自身稳定，从Globus等（1949年）以及Anderson等（1950）报告的病便支持上述论点，一例出现低血糖，另一例脑脊液葡萄糖极低，该两名儿童分别在接受百日咳菌苗后18和36小时发生惊厥。 Askelof等（1979年）报导给大鼠腹腔内注射百日咳菌苗后，其脑组织发生生物化学改变，在菌苗注射后24天，大脑内cGMP浓度增高，此与惊厥有关。 Park等（1983年）报导一例注射DPT后发生阵发性室上性心动过速。患儿在2月龄时第一次注射DPT和口服三价脊髓灰质炎疫苗，6小时后发生PST，注射心得安后迅速恢复正常窦性节律。4月龄时，再次注射DPT和口服三价脊髓灰质炎疫苗，5小时后心电图证实出现阵发性室上性心动过速，心律为300次/分钟，静脉注射心得安后，恢复窦性节律。5月龄时，第3次注射DPT，4 1/2小时后，突然尖叫，又出现阵发性室上性心动过速，心律300次/分钟。静脉注射心得安后，又恢复正常节律。7月龄时，第3次口服三价脊髓灰质炎疫苗，未发生不良反应。18个月龄时，仅注射白、破二联菌苗，未使用百日咳菌苗，未发生阵发性室上性心动过速。在注射麻疹、流行性腮腺炎和风疹疫苗后，未发生类似反应。由上述结果证实百日咳菌苗成分是诱发此种不良反应的因素之一。 Dick等（1983年）指出百日咳菌苗诱发大鼠改变心血管内2肾上腺素能和胆硷能反应，主要由菌苗中LPF引起抗胆硷能的2肾上腺素能阻断，此种心血管系统的自律性失调不仅在大鼠，也表现在人体，故一些儿童接受百日咳菌苗接种后，可发生自律性反应的严重损害，出现休克等一系列反应。 由于百日咳杆菌含有活性百日咳毒素，为引起菌苗反应的物质基础，因此制备无细胞菌苗将可减少菌苗的毒性反应。自1981年Munoz等制备晶化百日咳原获得成功后，又经戊二醛脱毒成为类毒素，它不具毒性而有强的免疫原性，为一种保护性抗原，将有希望作为幼婴儿一种有效的抗毒性疫苗。近年来已经应用基因工程突变的毒素作为抗原，取得了良好的疗效。近年来，日本、美国等许多学者已经研究制备百日咳无细胞菌苗代替全细胞菌苗，可显著减低全细胞菌苗的毒性反应。Robinson等（1983年）的实验结果证实，20多批无细胞菌苗与菌体菌苗同样有效，经过组织胺致敏、白细胞增多和内毒素等试验表明，其毒性仅为菌体菌苗的1/10。美国Conzales也于1982年研制新型百日咳无细胞菌苗，在得克萨斯州及亚利桑那州接种了数百名儿童，经现场考核结果认为新型无细胞菌苗比美国的全菌体菌苗反应小。Oda等（1983年）用无细胞菌苗与日本标准的全菌体菌苗分别免疫母鼠，然后攻击乳鼠，收集母鼠及乳鼠的血清，比较母鼠及乳嫌的血凝素抗体滴度，结果提示无细胞菌苗和全菌体菌苗组在传递血凝素抗体方面并无差异。无细胞菌苗与全菌体菌苗保护率基本相同，菌苗的保护作用主要经初乳传递，其中SlgA起重要作用，人类也经胎盘和初乳传递血凝素抗体，说明母体抗体通过胎盘/初乳传递，可能是婴儿在出生后几个月中能防御百日咳感染的原因。现在意大利和瑞典及塞内加尔的科学家们已经制备了无菌疫苗，接种后的效果与全菌疫苗相差无几，而毒副作用要小得多。对无菌疫苗的机理研究也已经相当深入，与无菌疫苗的抗原刺激细胞因子的产生和细胞因子受体的表达及调节B细胞免疫球蛋白的重链有关。 总之，百日咳菌苗的毒性反应使特异预防受到限制，应加在研制毒性低免疫效果好的无细胞菌苗。主要参考文献1. Caroff M et al. J Bacteriol 1994, 176: 51562. Amano KL et al. J Gen Microbiol 1990, 136: 4813. DiFabio JL