苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长效应研究.doc

8期 岳霞丽等：苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长效应研究1825苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长效应研究岳霞丽，张新萍，胡先文，董元彦（华中农业大学理学院，武汉 430070）摘要：【目的】研究苄嘧磺隆对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的生长效应，评价苄嘧磺隆的生态风险。【方法】通过不同浓度的苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的96 h急性毒性试验，研究苄嘧磺隆对小球藻的生长及藻细胞中叶绿素和蛋白质含量的影响。【结果】低浓度苄嘧磺隆（1 mgL-1）具有刺激藻细胞生长的作用，其叶绿素含量和蛋白质含量均有明显的增加；高浓度的苄嘧磺隆(5 mgL-1)抑制藻的生长，藻细胞叶绿素含量和可溶性蛋白质含量随药剂浓度增加而明显下降，且表现出较好的计量效应关系，其对蛋白核小球藻的96h-EC50值为15.7 mgL-1。【结论】苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长有一定的抑制作用，属低毒。关键词：苄嘧磺隆；蛋白核小球藻；生长；叶绿素；蛋白质Effect of Bensulfuron-Methyl on Growth of Chlorella pyrenoidosaYUE Xia-li, ZHANG Xin-ping, HU Xian-wen, DONG Yuan-yan(College of Basic Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)Abstract：【Objective】To study the growth effects of differing concentrations of Bensulfuron-Methyl on Chlorella pyrenoidosa and to evaluate the ecological risk. 【Method】The effects of Bensulfuron-Methyl on the growth and the content change of chlorophyll and protein in Chlorella pyrenoidosa were studied through 96 h acute toxicity tests. 【Result】Bensulfuron-Methyl accelerated the growth of algae at a lower concentration (5 mgL-1). The content of chlorophyll or protein in algae cells reduced with the increasing concentration of Bensulfuron-Methyl, exhibiting the good concentration-effect relationship. The 96h-EC50 of Bensulfuron-Methyl upon the algae was 15.7 mgL-1. 【Conclusion】Bensulfuron-Methyl has inhibiting effect on the growth of Chlorella pyrenoidosa and is lower toxicity.Key words：Bensulfuron-Methyl; Chlorella pyrenoidosa; Growth; Chlorophyll; Protein 0 引言【本研究的重要意义】藻类作为水生生态系统的初级生产者，对于生态系统的平衡和稳定起着极其重要的作用，也是监测评价水环境质量的重要指标13。研究苄嘧磺隆对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的生长效应，这对于揭示该类化合物对小球藻的毒性机理，评价农药生态风险具有十分重要的意义，也为探索监测水生生态系统农药污染的生态指标提供依 据46。【前人研究进展】苄嘧磺隆是20世纪70年代中期发展起来的一类高效、低毒农药，因其活性高、用量少、选择性强，且对人、畜低毒，现已广泛应用于水稻、玉米、油菜、小麦、大麦等农作物的田间除 草7,8。【本研究切入点】但随着磺酰脲类除草剂的开发和广泛应用，其残留物对后茬作物的药害及其引起的环境问题已成为其发展的严重障碍8。【拟解决的关键问题】本文选取自然界普遍存在的蛋白核小球藻为作用对象，研究苄嘧磺隆对小球藻的急性毒性试验及对藻的生长量、叶绿素含量、蛋白质含量等的影响，并对藻类能否降解磺酰脲类农药作初步探讨。1 材料与方法1.1 供试试剂及仪器苄嘧磺隆由上海农药研究所提供（纯度为99.1%）。试验所需主要仪器设备：显微镜、血球计数板、计数器、灭菌锅、锥形瓶、可见分光光度计、高速冷冻离心机。1.2 供试生物及其培养蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）购自中国科学院武汉水生生物研究所。藻的培养：在无菌条件下，取长势良好的小球藻接种到内盛SE培养基的250 ml锥形瓶中，在(252）、光强4 000 lx下连续照射，并向藻液中持续通入空气，进行培养。1.3 藻类生长量的测定9,10分别在培养24、48、72、96、120 h后，取样通过显微镜下血球计数板进行藻细胞密度计数，并在波长680 nm下测定藻液吸光度（A680），建立不同藻细胞密度与吸光度之间的线性关系。以计数的藻细胞密度和吸光度表示藻生物量，通过二者线性关系进行检验。1.4 苄嘧磺隆对小球藻的生长效应研究设置6个浓度组和一个空白对照，测定苄嘧磺隆对小球藻的急性毒性。每隔24 h取样测定藻液吸光度（A680）。用抑制率（I）-浓度对数值（lgC）法计算96 h时抑制率为50%的浓度值（96h-EC50）。1.5 叶绿素含量的测定在50 kPa压力下，用0.45 m微孔滤膜减压过滤藻液，然后将滤膜剪碎放入玻璃研钵，加入78 ml 90%乙醇研磨提取叶绿素，一并转入刻度试管中，用90%乙醇定容到10 ml，室温下置于暗处提取12 h。将提取液在3 0004 000 r/min下离心15 min，取上层清液，用90%乙醇定容至10 ml。以90%乙醇溶液作参比，用直径为1 cm的比色皿测叶绿素提取液在波长652 nm处的吸光度值。藻类叶绿素含量（mgL-1）=（叶绿素浓度提取液体积稀释倍数）/样品体积1.6 蛋白质含量的测定小球藻可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白作标准曲线。将一定量的藻液在4 000 r/min下离心15 min，弃去上层清液，加5 ml蒸馏水将藻转移到研钵中，研成匀浆，离心（4 000 r/min下离心10 min），将上清液倒入10 ml刻度试管中，再向残渣中加入2 ml蒸馏水，悬浮后再离心10 min，合并上清液，定容至刻度。以此清液进行可溶性蛋白质含量测定。蛋白质含量（mgL-1）=测得的蛋白质含量（mgL-1）提取液总体积（ml）/测定时取用藻液体积（ml）。2 结果与分析2.1 藻的测定方法研究细胞计数法是测定藻现存量的基本方法，也是确定其它测定方法有效性的依据。图1表明通过分光光度法测定的吸光度（A）与显微计数的藻细胞密度（C）之间有很好的线性关系，得到的线性回归方程为：A =1.2710-7 C-0.0038 R2 = 0.9973细胞计数法虽然操作简单，但计数工作量大，且重现性不好，人为因素影响大，误差大。采用分光光度法测定小球藻的现存量，操作简单，快速，测定时不破坏样品，且结果重现性好，误差小，特别适合连续测定，是一种简便、有效的测定方法。因而后续的测定均以分光光度法测藻液的吸光度来计量小球藻的现存量。2.2 不同浓度苄嘧磺隆对小球藻的生长效应从图2可知，不同浓度的苄嘧磺隆对小球藻的生图1 藻细胞密度与藻液吸光度（680 nm）的关系Fig. 1 Relationship between algae cell density and absorbance at 680 nm9期 岳霞丽等：苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长效应研究1825图2 苄嘧磺隆对小球藻生长效应的影响Fig.2 Effect of Bensulfuron-Methyl on growth of Chlorella pyrenoidosa长效应不同。与对照组相比，低浓度的苄嘧磺隆（ 5 mgL-1）的苄嘧磺隆则抑制小球藻的生长，且抑制程度与药剂浓度呈正相关，表现出明显的浓度效应相关性。如以96 h抑制率（I）-苄嘧磺隆浓度对数（lgC）作图，如图3所示，抑制率与浓度对数呈较好的线性关系，得到的线性回归方程为：I = 0.5854lgC 0.2008 , R2 = 0.973896 h半数致死浓度96h- EC50 = 15.7 mgL-1。参照有关建议标准4，苄嘧磺隆对蛋白核小球藻属于低毒。图3 96 h抑制率（I）与浓度对数（lgC）的关系 Fig.3 Relationship between 96 h-inhibition-rates and lgC2.3 苄嘧磺隆对小球藻叶绿素含量的影响由图4可知，加入苄嘧磺隆24 h后，小球藻叶绿素含量增加，但48 h后不同浓度的苄嘧磺隆对小球藻的作用效应各异。低浓度的苄嘧磺隆刺激了叶绿素的增长，使叶绿素含量增加；而高浓度的苄嘧磺隆则表现出明显的抑制作用，且随着浓度的增加叶绿素含量越来越低。这与试验过程中观察到的藻液越来越黄，最后呈现淡黄色一致。2.4 苄嘧磺隆对小球藻可溶性蛋白含量的影响图5显示了120 h内蛋白核小球藻总蛋白含量的变化。加药48 h内，蛋白质含量的变化并不明显，但48 h后蛋白质含量的变化与苄嘧磺隆的用量呈现明显的相关性。与对照组相比，苄嘧磺隆在低浓度时，使蛋白核小球藻的蛋白质含量增加，而在高浓度时使蛋白质含量降低。这可能是低浓度苄嘧磺隆促进小球藻生长，高浓度抑制小球藻生长的原因之一，同时也说明藻细胞蛋白质含量与其生长状态密切相关。图4 苄嘧磺隆对小球藻叶绿素含量的影响Fig.4 Effect of Bensulfuron-Methyl on chlorophyll content of Chlorella pyrenoidosa图5 苄嘧磺隆对小球藻蛋白含量的影响Fig.5 Effect of Bensulfuron-Methyl on protein content of Chlorella pyrenoidosa3 讨论藻类的生长涉及到光合作用、呼吸和细胞分裂等过程，其中任一环节受到干扰或破坏均可导致藻类生长受阻1113。深入研究农药对藻的毒性机制，可更客观地评价农药的生态风险，便于筛选高效、低毒的农药，对开发对环境友好的农药有着重要意义1417。在受农药污染的环境中，藻类是通过改变生长和蛋白质合成模式来适应变化了的环境18,19。在藻液中加入少量苄嘧磺隆，刺激了藻细胞叶绿素的生长，促进了光合作用的进行，并将农药作为营养物质吸收利用，促进藻的生长，使蛋白质含量增加20,21。而当苄嘧磺隆浓度超出一定范围，即超过藻的自我调节范围，随着苄嘧磺隆浓度增加，对藻类生长阻碍作用逐渐增强，藻细胞结构被破坏，藻液变黄，叶绿素含量下降，抑制藻细胞的合成，蛋白含量亦随之降低。这与欧晓明、聂湘平等的研究结果相似14,17,22，因而可以说，农药对藻的毒害和藻对农药的降解两种作用在藻与农药的相互作用过程同时存在，只是在不同浓度范围内，占主导地位的作用不同，因而表现出不同的作用效果。当苄嘧磺隆浓度较低时，藻类可能降解农药，将其作为营养物质吸收利用，从而促进藻的生长；而当苄嘧磺隆浓度较高时，农药对藻的毒害作用占主导地位，因而表现为抑制藻的生长。加强藻类降解农药机理的研究，利用藻类降解农药无疑也为改善生态环境提供了一条经济有效的途径。4 结论不同浓度的苄嘧磺隆对小球藻表现了不同的作用效果。低浓度的苄嘧磺隆能（5 mgL-1）则抑制小球藻的生长，相应叶绿素含量和蛋白质含量降低，且苄嘧磺隆对蛋白核小球藻的生长作用表现出明显的计量效应关系, 其对蛋白核小球藻的96h-EC50值为15.7 mgL-1，属低毒。藻类在自然界分布很广，在农田中是影响土壤肥力的重要因素，在水域中又是鱼类饵料的重要来源，在水生生态系统中占有十分重要的地位21。由于农药在世界范围内的广泛使用，必将对藻的生存、生长、繁殖带来一定的影响，研究农药对藻类的中毒症状和毒性影响具有十分重要的意义，同时也是评价农药对环境安全性的一项重要指标。References1 孙红文，黄国兰.藻类与有机污染物间的相互作用研究. 环境化学，2003，22：440-444.Sun H W, Huang G L. 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