三种美白剂对酪氨酸酶活性的抑制

三种美白剂对酪氨酸酶活性的抑制陆晔周名权翁康生刘国星(上海市疾病预防控制中心分子生物与基因实验室200336)Inhibition of Tyrosinase Activity by Three White - ma king IngredientsL u YeZhou MingquanWeng Kangsheng L iu Guoxing( Molecular Biology and Genet ic La boratory , Shangha i Mun ic ipal Center f orD isea se Prevent ion and ControlShangha i200336 , China)AbstractTyrosinase is t he key enzyme in t he p roductio n p rocedure of melain. The quantit y of melain can be co nt rolled by rest ricting t he activit y of t yrosinase. The effect s of t hree co mmo n white - making ingredient s , which are Hydroquino ne , Arbutin ext ract and Kojic acid , o n tyrposinase were detected wit h L - Tyrosine as subst rate in vit ro . The result s showed t hat all of t hese ingre2 dient s had inhibitio n effect in different degree respectively. The mechanism of t heir white - making effect was discussed briefly.Key words :White - making ingredient s Tyrosinase摘要酪氨酸酶为黑色素生成的关键酶 ,抑制其活力即可抑制黑色素的生成 。用 L - 酪氨酸酶作底物 ,体外测定了三种常 用美白剂 (对苯二酚 、熊果苷 、曲酸) 对酪氨酸酶活性的影响 。发现这些美白剂均能不同程度地抑制酪氨酸酶活性 ,并初步探讨了其增白作用的机制 。关键词 :美白剂 酪氨酸酶决定皮肤色调的因素主要是皮肤内的黑色素 ,肤色的深浅主要是决定于黑色素细胞的量及 细胞合成黑色素的能力 。传统的皮肤生理学认 为 :黑色素细胞内含有的酪氨酸 ,在酪氨酸酶的作 用下 ,逐渐氧化成多巴 ,多巴醌 ,中间代谢产物多 巴醌再经过一系列的代谢过程 ,重新排列并聚合 , 最后与蛋白质结合为黑色素蛋白1 。根据 以 上 原理 ,在美白化妆品中添加能抑制酪氨酸酶活性 的美白剂 ,通过抑制酪氨酸酶活性直接抑制黑色 素的形成 ,从而达到美白皮肤的目的 。本文研究 了三种常用美白剂 (对苯二酚 、曲酸 、熊果苷) 对酪 氨酸酶活性的抑制作用 ,并初步探讨了其美白作 用的机制 。1实验材料L - 酪 氨 酸 购 自 美 国 Sigma 公 司 。对 苯 二酚 、曲酸 、熊果苷由本中心环境卫生科吴尉平医生提供 。Superdex 75 HR10/ 30 预装柱为 Phar macia 公司产品 。垂直电泳仪为 Hofer 公司产品 。紫外 分光光度计为 Phar macia 公司产品 。2实验材料2 . 1酪氨酸酶的提取参照文献 2 的方法加以改进 。取 60g 土豆 , 加 125 ml 磷酸钠缓冲液 ( PB S) p H8 . 0 ,搅拌机中搅 碎 ,5000g ,离心 15 min 。取上清 ,加入饱和硫酸铵 至 55 % 饱 和 度 , 室 温 沉 淀 30 min , 5000g , 离 心30 min 。取沉淀 , 溶于适量 dd H2 O 中 , 0 . 02 mol/ L PB S 透析过夜 , 得到土豆提取物粗制品 。取 1 ml粗制品 ,上 Superdex 75 HR10/ 30 预装柱 ,以0 . 02 mol/ ml PB S 洗脱 。收集第一洗脱峰 ,得到土豆中 的酪氨酸酶 。用 4 % 20 %梯度 PA GE 检测其收稿日期 :2001 - 06 - 11 15综述与专论第五期三种美白剂对酪氨酸酶活性的抑制总第六十八期纯度 , Folin - 酚试剂法测定酶浓度 。品梯度 PA GE 仅一条带 , 基本不存在其他杂带 ,且条带位置与酪氨酸酶标准品相一致 。经酶活性 测定 ,该样品存在酪氨酶活力 。与此相反 ,2 号峰 样品有多条杂带 ,且不具酪氨酸酶活力 。因此 ,1 号峰即为所需的土豆中的酪氨酸酶 。3 . 2对苯二酚对酪氨酸酶活性的抑制 取适量的对苯二酚溶于水 ,使其浓度范围为8g/ ml48g/ ml ,测酪氨酸酶活力 。空白对照为 同体积的 ddH2O 。计算酶活力的抑制率如图 (3) 。2 . 2酪氨酸酶活性的测定参照文献 23 的方法 。3 ml 反应体系中 ,含酪氨酸酶液0 . 66mg/ ml ,L2酪氨酸 0 . 607 mg/ ml , PB S ( p H8 . 0 ) 1 ml及不同 浓 度 美 白 剂 。分 别 测 初 始 O . D . 305 及37 水浴 5 min 后 O . D . 305 ,以A/ min 计算酶活 力 。1 活力单位 ( U ) = 0 . 001A/ min 。则美白剂 对酶活力的抑制率 I = ( 1 - A/A) 100 % ,其 中A为加入美白剂后的酶活力 ,A 为空白对 照 。3实验结果3 . 1土豆中酪氨酸酶的提取 土豆的粗制品经 Superdex 75 HR10/ 30 柱洗脱后 ,所得的洗脱峰如图 ( 1) 。收集的样品走 4 %20 % PA GE ,结果如图 (2) 。图 3对苯二酚对酪氨酸酶活力的影响可见 ,对苯二酚在浓度为 8g/ ml 48g/ ml范围内 ,对酶活力有抑制作用 。该抑制作用在对 苯二酚浓度为 16g/ ml 时达到最大值 。3 . 3熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制 取适量的熊果苷溶于无水乙醇 ,使其浓度范围为 8g/ ml 48g/ ml , 测酪氨酸酶活力 。空白对照为同体积的无水乙醇 。计算酶活力的抑制率 如图 (4) 。图 1土豆提取物洗脱峰图 4熊果苷对酪氨酸酶活力的影响可 见 , 熊 果 苷 在 浓 度 为 8g/ ml 及 16g/ ml时 ,对酪氨酸酶活力无影响 。在浓度 24g/ ml 48g/ ml 范围内 , 对酶活力有抑制作用 。该抑制 作用在熊果苷浓度为 48g/ ml 时达到最大值 。3 . 2曲酸对酪氨酸酶活性的抑制 取适量的曲酸溶于水 ,使其浓度范围为 8g/ml48g/ ml , 测酪氨酸酶活 力 。空 白 对 照 为 同图 2土豆提取物 4 %20 % PA GE 结果M :蛋白质标准品 ;A :2 号峰样品 ;B :酪氨酸酶标准品 ; C :1 号峰样品可见土豆中主要存在 2 个样品峰 。1 号峰样 16香料香精化妆品二 一年十月疗色素沉着性疾病时 ,仍可使用6 。与对苯二酚相似 ,熊果苷在渗入皮肤后 ,也能 破坏黑色素细胞 ,造成细胞结构的改变 ,从而能有 效地抑制细胞内酪氨酸酶的活性7 。熊果 苷 的 抑制作用相对较温和 ,在本实验检测浓度范围内 基本上是三种美白剂中最弱的 ( 图 6) ,并且只有 在浓度达到最大 ( 48g/ ml ) 时 , 才有较高的抑制 率 ( 80 %) 。虽然熊果苷的美白作用相对较弱 , 但由于它对皮肤细胞的影响较小 ,对光和热的稳 定性又高于曲酸 ,因此目前发达国家的美白护肤 品市场已被熊果苷所垄断8 。与对苯二酚 、熊果苷不同 ,曲酸是一种金属螯 合剂 。它通过螯合酪氨酸酶结构中的铜离子 ,使 酶失去原有的活性 ,从而有效地抑制黑色素的形体积的 dd H2 O 。计算酶活力的抑制率如图 (5) 。图 5曲酸对酪氨酸酶活力的影响可见 , 曲酸 在 浓 度 为 8g/ ml 48g/ ml 范 围 内 ,对酶活力有抑制作用 。但这种抑制作用随曲酸浓度增大 ,抑制率反而降低 。提示曲酸对酪氨酸酶活性的抑制机理可能不同于对苯二酚和熊果苷 。4讨论酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶 。该酶是一 含有 约 10 %血 清 型 糖 链 的 膜 结 合 型 糖 蛋 白4 。它是一种含铜需氧酶 ,其活性与游离铜离子含量 成正比 。酪氨酸酶的活性分为酪氨酸羟基酶和多巴羟基酶两方面 :前者将酪氨酸转变成多巴 (二羟 基苯 基 丙 氨 酸 ) ; 后 者 将 多 巴 转 变 成 多 巴 胺4 。本实验测定的主要是酪氨酸羟基酶的活性 。 本实验所用的三种美白剂都能有效地抑制酪氨酸酶的活性 ( 抑制率 50 %) ,但作用机理并不 一样 。对苯二酚通过产生半醌自由基 ,选择性作 用于黑色素细胞膜 ,使细胞膜受损 ,与膜结合的酪氨酸酶也同时失去活力5 。对苯二酚对酪 氨 酸酶活力的抑制作用较强 。在本实验检测浓度范围 内抑制率一直大于 80 % ( 图 6) ,并且仅需较低浓 度 (16g/ ml) ,即可达到较高的抑制率 ( 90 %) 。 这种抑制作用同时具有高度诱发突变及细胞毒作 用 ,因此在皮肤美白剂中已禁止使用 ,仅在临床治成8。由于对酶抑制机理的不同 ,在本实验检测浓度范围内 ,曲酸对酶的抑制率随试样浓度的增大反而降低 (图 6) 。提示曲酸对酪氨酸酶活力的 抑制可能不是在酪氨酸羟基酶活性方面 ,而是在 多巴羟基酶活性方面 ,有待进一步的研究 。参考文献阎世 翔. 化 妆 品 科 学 ( 下 册) , 北 京 : 科 学 技 术 文 献 出 版 社 ,1998 :186191赵荧 ,高波 ,郑玉娟等. 牛磺酸对酪氨酸酶的抑制作用 , 中国 生化药物杂志 ,1999 ,20 ( 1) :1314韩强 ,林惠芬 ,朱琳莉. 几种中药提取物对酪氨酸酶活性的抑 制 ,香料香精化妆品 ,1998 ( 4) :2223毛培坤 ,张宝旭. 化妆品功能性评价和分析方法 , 北京 : 中国 轻工业出版社 ,1998 :356359肖子英 编 著. 实 用 化 妆 品