项目名称 高等植物蛋白质修饰与降解调控的分子机理研究 首席科学家.doc

项目名称：高等植物蛋白质修饰与降解调控的分子机理研究首席科学家：谢旗 中国科学院遗传与发育生物学研究所起止年限：2010.9至2015.9依托部门：中国科学院二、预期目标 (一) 总体目标本项目将从鉴定主效基因及其功能研究、基因调控、蛋白质组学、信号传递、决定生长发育及抗逆相关的重要农艺性状等入手，对相关的基因及农艺性状从分子生物学、遗传学及生理学等多个学科的综合研究，从蛋白质定位、蛋白质互作、蛋白质表达及调控的生物学功能等整体网络上揭示植物蛋白质修饰与降解动态变化过程的分子机理，提高我国生命科学的基础研究水平,从而增强我国科技竞争力。通过本项目的实施，预计将在以下几个方面取得突破：1. 阐明高等植物蛋白质重要修饰过程与泛素降解调控机制和网络，取得一批重大的原始创新性科学成果。2. 阐明植物蛋白质修饰与降解过程中关键因子和底物作用的重要生物学效应，发掘一批控制植物生长与耐性的重要功能基因，为我国农作物品种改良等多性状分子设计提供依据。3. 通过项目的实施，培育和造就一批在国际上具有影响力、在国内具有引领作用的优秀中青年研究人才，进一步提升我国在植物科学的研究水平，使我们在该领域的研究进入国际领先行列。 (二) 五年预期目标利用已有的工作基础，在植物蛋白质重要修饰过程、泛素降解调控机制和网络的分子机理及其重要生物学效应等方面取得突破性进展，使我国在植物蛋白质科学的理论和应用研究方面达到国际前沿水平，具体目标包括：1) 明确多个受体类激酶、CDPKs、CIPKs类激酶和乙烯受体激酶的功能与作用，鉴定出与这些蛋白激酶互作的部分上、下游蛋白因子，提出2-3条通过RLK、CDPK、CIPK或乙烯受体调节的植物响应逆境胁迫的分子调控网络途径。2) 确定受蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶调控的靶基因和信号转导途径；筛选鉴定拟南芥中与蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白。3) 阐明调控植物蛋白在细胞膜-细胞核内穿梭和定位的元件蛋白，及其在细胞内定位与调控水稻穗型发育和产量的关系。分离和鉴定3-5个参与茉莉酸调控生长素极性运输的PIN蛋白内吞和降解的分子调控元件并阐明其作用机理。4) 从分子生物学揭示泛素介导的蛋白降解途径最重要的信号传递因子，包括调控与生长发育相关的植物激素JA、ABA和GA积累的信号传递调控的分子机制及与逆境胁迫应答相关的信号传递的分子机理。5) 通过相关突变体的筛选，克隆蛋白质重要修饰过程与泛素降解调控途径相关的关键基因20-30个，并对其中的15-20个基因进行详细的基因结构、表达调控、基因功能等研究，建立相关调控网络1-2个。6) 在国际著名学术刊物上发表有较大学术影响的论文，发表SCI论文30篇、累计影响因子达150以上。申请专利5-7项。培养本领域的学术带头人6人以上。培养博士研究生60人，博士后20人。三、研究方案总体研究方案(一) 学术思想及技术路线蛋白质功能的研究从过去的单一蛋白研究发展到现在的蛋白组学的研究，尤其在真核生物中蛋白质翻译后不同的修饰作用及复杂的相互交叉已被人们认识。我们集中蛋白质研究不同领域的力量，设计从重要蛋白的相应基因的突变体入手，鉴定参与蛋白功能调节的关键基因。(1) 利用高表达、突变体研究基因及所编码蛋白功能。利用酵母双杂交及免疫共沉淀等方法分离相互作用蛋白，并进一步利用体内检测方法（如BiFC）确定蛋白互作关系。采用植物容易转基因的特点，在突变体的背景中高表达或敲除相互作用蛋白的基因，通过研究蛋白修饰水平的改变、定位的改变及降解特性的改变来研究蛋白功能。(2) 进行功能位点的突变，将突变的蛋白在植物中进行转基因表达，研究其功能及相互作用蛋白的动态变化及生物学效应。(3) 根据植物基因组在进化过程中产生的基因冗余的特点，我们在研究一个关键蛋白时，同时研究其家族蛋白的功能。根据植物基因表达位置的特异性及交叉性，研究家族成员之间的共性与特异性。这个思路将贯穿于本项目的课题一到课题四中，从蛋白的各种不同修饰到蛋白的定位及降解。研究方案技术路线图如下： (二) 与国内外同类研究相比本项目的创新性和特色1. 科学问题的前沿性：本项目以我国粮食安全重大需求为导向，瞄准国际科学前沿，凝炼研究目标，揭示控制植物修饰过程与泛素降解途径的调控机理。集中开展重要农艺性状（产量）相关的分子基础研究，阐明植物生长发育重要性状的分子基础。2. 新的总体研究方案：新的总体研究方案根据植物遗传资源的特殊性及动物中生物化学技术的成熟发展，将遗传学研究与分子生物学研究结合起来，充分利用生物信息，实现遗传学研究和生物学研究的优势互补的整合。3. 新的研究策略：突破国内外将蛋白的功能研究集中于单个蛋白功能的研究上，注重蛋白的各种修饰及相互作用蛋白的研究，研究各种修饰的竞争性及促进作用。例如，我们可以结合染色质免疫共沉淀和新一代高通量DNA 测序技术(Solexa)，使我们能在全基因组水平上揭示参与组蛋白共价修饰的靶基因和调控网络。4. 新的研究方法：在大规模蛋白质表达的基础上，应用最新的蛋白芯片系统进行筛选，从而实现制备的规模化和高通量化。在借助自动化、快速、高通量的相互作用技术平台分析之后，还需要结合其它辅助的技术平台协同验证这些相互作用，主要有细胞双杂交技术、荧光共振能量转移（FRET）技术和表面等离子体共振技术。针对不同蛋白相互作用的研究采用不同的研究方法。例如，对膜蛋白的相互作用蛋白的分离我们采用泛素重组的双杂交系统，而对定位我们采用荧光蛋白加上photobleaching的新技术来进行研究。5. 关键科学问题的创新性：我们的研究重点在于不同植物激素调节的蛋白质功能及效应。这是因为植物的生长发育、生殖以及环境的相互作用从根本上来说都是由不同的植物激素的调控来完成的，所以我们将研究的关键问题集中于解析植物激素信号转导途径中的关键蛋白及其互作蛋白的功能，同时考虑到不同植物激素交叉调节研究关键蛋白的功能。6. 研究材料的独特性：本研究主要利用已知基因组序列、遗传背景清楚、大量突变体积累的模式植物水稻和拟南芥的为研究材料。(三) 本研究项目实现预期目标的可行性1. 研究优势：近年来分子生物学研究飞速发展，拟南芥及水稻基因组已相继完成测序。其它主要作物的基因组测序工作也在筹划或正在进行。这些基础平台可有力推进本项目的顺利开展。2. 资源优势：植物蛋白质修饰与动态变化基础生物学的研究已开展多年，目前已克隆了大量与蛋白功能有关的基因，大量突变体的积累提供了非常有力的保障。目前我们拥有一大批与项目有关的拟南芥突变体、部分水稻突变体以及各种蛋白双杂交文库（核系统、膜系统）。本项目实施的前两年里我们在克隆有关基因的同时，还会进行与有关基因相互作用蛋白的突变体的高通量筛选，保证本项目在整个执行阶段都有高产出的科研成果。3. 技术优势：本项目所提出的所有研究内容都是建立在以往的工作基础之上。实验中所需要的所有条件都已具备。此外，分子生物学和生物化学所有的技术和方法，如生物信息技术、突变体筛选技术、差异显示技术、DNA芯片技术、常规分子生物学技术、常规生化技术、蛋白分离与分析技术、信号蛋白检测技术、瞬时表达技术、双杂交技术、显微操作和定位技术等都是项目组有关成员多年来经常采用的技术。泛素体内分析系统、蛋白细胞内相互作用实时荧光测定技术为项目的顺利进行提供了保障。4. 人才优势：项目组主要成员有多年从事植物遗传学、分子生物学等研究的经验，在Cell, Nature, Science, Nautre Genetics，Genes & Development, PNAS, Plos Genetics，Plant Cell, Plant Journal，Plant Physiology等国际期刊上发表多篇蛋白功能相关的论文。此外，这些人员大部分都曾在国际上著名的从事植物分子生物学研究的实验室中工作多年，和国际权威人士建立了良好的关系。国际间信息和物质的交流必将大大提高工作的效率，对本项目的开展是一个有力的支持。同时本项目在已有优势人才的基础上，围绕关键科学目标进一步优化了现有队伍，建立起优势互补、联合攻关的协作团队。课题设置本项目将实行首席科学家全权负责制，组织我国在植物蛋白基础研究上具有长期研究基础及特色的单位参加，按照“有所为，有所不为”的原则，从国家的经济发展需求出发，瞄准国际发展前沿，突出研究几个重要问题。根据总体研究计划及研究内容，选择优势单位中长期从事本项目的专家承担研究任务，成立项目核心成员管理委员会，进行课题的组织、分解、经费协调，充分保证各课题间的有机协作，互通有无，提高效率。在科技部的领导下，采取中期评估、滚动管理的方式，监督项目按预定计划顺利完成，对不能按期完成计划的课题，首席科学家有重新调整的权利。首席科学家将充分发挥课题负责人的作用及学术带头人作用。按照科学问题，进行课题的设置:课题1、植物蛋白的重要修饰过程与调控机理设置思路：本课题拟围绕植物生长发育的特异性及其与环境的互作,着重研究细胞中重要功能蛋白的磷酸化、甲基化和糖基化修饰过程在植物植物生长发育的不同阶段及在植物响应干旱、高盐、营养（磷钾）亏缺等环境胁迫的分子调控机理的特异性及生物学效应。主要研究内容：主要以拟南芥和水稻为材料，综合利用遗传学、细胞生物学、生物化学和蛋白组学等手段，重点研究磷酸化过程中的LRR-RLKs的磷酸化和钙信号感受器中CDPK、CIPK类激酶调控机理和网络，初步阐明它们与其它途径互作的分子机制；寻找与蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它们作用的底物和靶基因，确定受蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶调控的靶基因和信号转导途径；明确精氨酸甲基化和组蛋白去甲基化所参与的基因和蛋白质调控网络。具体包括：1) LRR-RLKs的磷酸化如何受体内、外各种因子的调控和揭示LRR-RLKs 的生物学功能，阐明SERKs是如何通过特异性磷酸化来激活多条信号途径的分子机理。我们将利用蛋白质组学的方法深入揭示这种特异识别过程在磷酸化水平上的分子机理。2) CDPK、CIPK类激酶基因缺失或过量表达时植物对逆境胁迫响应的表型及生理生化差异分析；与CDPK、CIPK类激酶互作的上、下游蛋白因子的筛选鉴定，并进一步对这些因子的遗传、表型及对逆境胁迫的反应进行分析； CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内、外磷酸化作用及调节分析，明确CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内、外磷酸化作用。3) 研究NTHK1的各结构域和激酶活性是否调控植物生物学反应。鉴定相互作用蛋白，用Pulldown及共定位实验进行验证；研究乙烯受体及信号转导蛋白NTHK1, OsETR2和MHZ1等的激酶活性是否调控植物生物学反应。鉴定相互作用蛋白，研究上述激酶是否磷酸化筛到的互作蛋白及是否调控相应的生物学反应。4) 明确蛋白质精氨酸甲基转移酶AtPRMT10和AtPRMT5在开花信号调控网络中的作用；揭示组蛋白去甲基化酶AtJMJ14催化的表观修饰调控植物生长和开花发育的分子机制。预期目标：建立通过LRR-RLK、CDPK、CIPK类激酶和乙烯受体激酶磷酸化调控作用的植物响应逆境胁迫及其它生物学反应的分子调控网络模型，为较全面地解析植物适应环境胁迫的分子调控机理和抗逆性状的分子遗传网络机制做出理论贡献；阐明蛋白质精氨酸甲基化和组蛋白去甲基化修饰对开花发育的调控作用机理。明确精氨酸甲基化和组蛋白去甲基化修饰的基因和蛋白质调控网络，为表观遗传调控机理提供理论依据。发表SCI论文9篇、累计影响因子大于45；培养研究生15名、博士后2人，申请专利2-3项。课题承担单位：兰州大学，中国农业大学，中国科学院遗传与发育生物研究所课题负责人： 黎家，教授，博士，兰州大学主要学术骨干：杨淑华，教授，博士，中国农业大学曹晓风，研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所陈丽梅，副教授，博士，中国农业大学苟小平，教授，博士，兰州大学经费比例：29%课题2、植物蛋白泛素化降解的机理与调控作用设置思路：尽管国内外对泛素介导的蛋白降解途径进行了广泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已经取得了重要的进展，但是关于泛素蛋白降解机制及其参与植物正常生长发育与植物抵抗逆境胁迫的作用机制的研究刚刚起步，特别是蛋白质其它修饰是如何影响泛素蛋白调控过程及在植物中的特异性还知道甚少。针对这些关键科学问题的重要性和紧迫性确定以下研究内容。主要研究内容:本课题拟将遗传学与分子生物学研究相互结合、优势互补，以解析植物生长发育过程以及逆境信号传导过程相关的泛素介导的蛋白降解途径中主效基因的功能为主要研究线索，以植物生长发育及逆境引起的上游信号传递研究为突破口，对植物体内蛋白降解机制进行系统的研究。具体包括：1) 拟南芥中泛素蛋白体系中26S蛋白酶体组成在植物的不同发育阶段、组织特异性及环境适应性方面的特异性功能和调控，鉴定特殊组织和特异环境中植物中新的复合体及调控功能。2) 植物泛素结合酶 (E2) 家族不同成员的功能特异性、与泛素连接酶 (E2) 的特异性互作在底物识别中的调控作用以及特异性互作的生物学效应。3) 泛素连接酶体SCF复合体和单亚基RING(U-box) E3 介导的底物泛素化及泛素化降解的机制和调控。底物的泛素化位点的鉴定及底物的稳定性的生物学调控。4) 植物内质网介导的蛋白降解 (ERAD) 途径中DOA和HRD复合体在植物激素信号传导途径和植物对生物和非生物逆境响应中的特异调控。5) 蛋白的泛素化修饰及其介导的蛋白降解途径在植物有性生殖以及胚胎发育过程中的作用却了解甚少。拟以分离到的RING的突变体为切入点，来研究蛋白泛素化修饰在植物配子体发育及胚胎发育过程中的调控机制。6) 构建拟南芥赤霉素相关的突变体库，分离鉴定能够改变GID1-DELLA-SCFSLY1蛋白复合体亲合力进而影响DELLA蛋白的降解，或者影响DELLA蛋白的生物功能活性的res突变体。进一步基因克隆和后续蛋白功能分析，揭示RES基因在提高赤霉素信号传导中的作用机理。预期目标：初步揭示并完善植物中泛素介导的蛋白降解途径相关的遗传学及分子生物学基础。从分子生物学揭示泛素介导的蛋白降解途径最重要的信号传递因子，包括调控与生长发育相关的植物激素JA和GA积累的信息传递调控机制及与逆境胁迫应答相关的信息传递的分子机理。发表SCI论文7篇、累计影响因子大于35；培养研究生15名、博士后2人，申请专利1-2项。课题承担单位：中国科学院遗传与发育生物研究所，北京大学课题负责人： 谢旗，研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所主要学术骨干：瞿礼嘉，教授，博士，北京大学杨小元，副研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所刘敬婧，副研究员，博士，北京大学高利艳，助理研究员 博士，中国科学院遗传与发育生物研究所经费比例：25%（3%组织协调和数据库建设）课题3、植物细胞内蛋白质运输与定位的动态变化机制设置思路：高等植物生长发育变化适应环境改变的分子机制目前仍不清楚，但植物内源激素及其信号传导途径在适应环境过程中扮演着极其重要的功能。最近通过模式植物拟南芥的根系发育的研究发现，逆境胁迫时，拟南芥控制植物激素运输的转运蛋白在细胞中的定位和质量控制发生改变，从而导致一系列的根系发育变化。但对于如何通过内吞小泡使转运蛋白快速从细胞一侧运送到另一侧的调控机理不清楚。转运蛋白的质量控制是由于新合成的蛋白不能定位到质膜上，还是由于不能正确折叠或折叠不完全而被降解所致的分子机理也不清楚。针对这些关键科学问题的重要性确定以下研究内容。主要研究内容：本课题拟将遗传学、细胞生物学和生物化学研究相结合，在植物在生长发育以及环境互作过程中，以控制植物生长发育和激素分布的关键功能蛋白在细胞内穿梭、定位以及其质量控制为主要研究突破口，明确与细胞膜、细胞质和细胞核定位的关键结构域，重点研究蛋白质的修饰和互作蛋白结合对其定位和蛋白质量控制的影响，揭示植物蛋白质胞内转运和动态定位变化的分子调控机制。具体包括：1) 前期研究发现DEP1蛋白是一个能在细胞膜与细胞核之间穿梭的蛋白，在不同发育阶段和不同组织中也有不同的定位模式，通过遗传筛选影响DEP1-GFP蛋白在细胞内转运和定位的red突变体（Repressor of dep-1)，克隆RED基因并研究其生物学功能。2) 通过DEP1蛋白不同功能域的突变、缺失和置换研究影响DEP1蛋白细胞内运输和定位的关键功能域，通过酵母杂交筛选和鉴定DIP（DEP1-interacting proteins）蛋白，深入研究DIP的生物学功能，明确DIP- DEP1互作共同实现细胞内运输与定位的蛋白作用机理。3) 前期研究发现调控生长素运输和水稻分蘖角度的重要蛋白LAZY1 (LA1)是一个在细胞膜与细胞核之间穿梭的蛋白，其膜定位和核定位对于LA1的功能都是必需的。在此基础上，通过基因突变研究确定LA1定位的关键结构域；利用酵母双杂交系统筛选与LA1互作共同实现穿梭的蛋白因子；分析LA1转录后修饰和LA1互作蛋白的结合如何调控LA1蛋白的定位模式及其穿梭的机制。4) 茉莉酸和生长素互作调控PIN蛋白内吞和降解的机制。前期研究发现茉莉酸既可通过ASA1基因上调生长素生物合成，又可以通过影响PIN蛋白在质膜和胞内体(endosome)之间的运输而下调生长素极性运输，从而精细调控植物侧根发生以增强对外界环境的适应性。通过遗传筛选获得了8个抑制asa1-1突变体表型的soa (suppressor of asa1-1)突变体。我们将克隆这些SOA基因并阐明其作用机理。预期目标：明确LA1被修饰的特性及这种修饰对LA1在细胞膜与细胞核之间穿梭的作用，鉴定1-2个与LA1互作共同实现穿梭的重要因子；分离拟南芥中参与茉莉酸介导的生长素转运的新基因，并研究其调控PIN蛋白内吞和降解的机制；着重研究2-3个影响DEP1蛋白的运输与定位的新调控元件；初步揭示并完善转运蛋白的定位与质量控制及其调控高等植物生长发育和环境适应的分子机制。发表SCI论文7篇，累计影响因子大于35，培养研究生15名、博士后2人，申请专利1-2项。课题承担单位：中国科学院遗传与发育生物研究所，兰州大学课题负责人： 傅向东，研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所主要学术骨干：李传友，研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所王永红，研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所刘学英, 助理研究员,博士，中国科学院遗传与发育生物研究所经费比例：24%课题、蛋白修饰和降解调控植物生长发育的分子机制设置思路：蛋白特异性修饰和降解信号转导途径的研究是近年基础生物学研究的前沿领域。目前，尽管国内外对蛋白修饰和降解途径进行了广泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已经取得了重要的进展，但是一方面关键元件知道甚少，另一方面如何调控植物生长发育及逆境耐性的重要生物学功能还不清楚，因而极大地限制了通过基因工程提高植物抗逆性在农业生产中的应用。针对目前存在以上科学问题，确定以下研究内容。主要研究内容：本项目拟将遗传学与分子生物学研究相互结合、优势互补，以植物生长发育过程以及逆境信号传导过程相关的蛋白降解途径中主效基因的功能为主要研究线索，以植物生长发育及逆境引起的上游信号传递及降解复合体如何构成的关键问题为研究突破口，对植物体内蛋白降解机制进行系统的研究。具体包括：1) 蛋白降解与水稻株型及种子发育的调控，研究F-box类蛋白初调控水稻株型及种子发育的机理，寻找降解过程受其调节的靶蛋白，深入研究该F-box蛋白调控水稻株型及发育性状的分子调控机制。2) 拟南芥中泛素蛋白介导的植物激素茉莉素信号传导途径的研究, 研究SCFCOI1泛素连接酶复合体介导的植物雄性不育等生长发育过程的分子机制。进一步鉴定与SCFCOI1泛素连接酶复合体介导的茉莉素信号转导途径有关的重要基因和蛋白的功能。3) 拟南芥和水稻中参与生物和非生物逆境胁迫下植物防御反应的基因功能及其参与的蛋白降解机制的研究。通过系统的分子和生物化学分析研究研究F-box蛋白DOR作用的分子机理，进一步探讨拟南芥干旱胁迫的分子机制，为利用该基因提高植物抗旱性提供理论依据。4) 研究阐明VER2通过影响FLC位点组蛋白修饰进而调控拟南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制。研究植物细胞内的O-GlcNAc信号及其与春化响应表观遗传机制之间的关系，探讨蛋白的O-GlcNAc修饰对春化相关蛋白活性的调控机制。预期目标：克隆5-10个修饰和降解调控的靶基因并深入解析其功能和作用机制，同时评估2-3个基因的应用价值，阐明南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制和进一步探讨拟南芥干旱胁迫和生物胁迫的分子机制，为利用该基因提高植物抗旱性和抗病虫提供理论依据。发表SCI论文7篇，累计影响因子大于35；培养研究生15名、博士后2人，申请专利1-2项。课题承担单位：清华大学，中国科学院遗传与发育生物研究所，中国科学院植物研究所课题负责人： 谢道昕，教授，博士，清华大学主要学术骨干：刑利静，副研究员，博士，中国科学院植物研究所张玉娥，副研究员，博士，中国科学院遗传与发育生物研究所张贵友，副教授，博士，清华大学经费比例：22%根据本项目关键科学问题和总体设想，设立以上个相应的研究课题。课题1着重于植物蛋白质翻译后加工、修饰的发生、调节及生理效应基础研究，目的是建立基础平台；课题着重于细胞内蛋白质降解的机理及胁迫条件下蛋白质的行为和命运；课题着重于蛋白质在细胞内的定位、跨膜转运和动态转位的机理、调节和效应；课题则是在前个课题的基础上，或者说在已获得有关主效基因的基础上，研究如何通过一个到少数几个基因的合理操纵即可实现动态互作网络的构建。本研究所涉及到的两个主要关键科学问题，即高等植物蛋白质修饰与动态变化，两者是相互关联，互为补充的。课题之间的相互关系如下：蛋白磷酸化途径的调控 蛋白降解调节的机理 降解和修饰所调控的靶标 植物蛋白质功能研究 蛋白质运输与定位的机理甲基化、蛋白糖基化 四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1. rmst1和red1突变体表型的具体分析；2. 通过PCR的方法检验rmst1和red1突变体中突变基因的基因型是否与表型共分离；突变体的表型互补实验；3. 完成克隆拟南芥中已克隆但未能表达的E2在植物活体中的表达和活性鉴定；4. 筛选水稻中有表型的E2的相关突变体；5. 鉴定26S蛋白酶体的特异性组装；6. 利用酵母双杂交和免疫共沉淀分离互作蛋白；筛选LA1的相互作用蛋白；7. 利用体内检测方法（如BiFC）确定5-10个重要蛋白互作关系；8. 构建拟南芥赤霉素相关的突变体库，并开展相关遗传筛选；9. 利用EMS化学诱变，构建DEP1-GFP转基因水稻突变体库，遗传筛选red突变体；10. 创制DEP1蛋白不同结构域突变、缺失和置换，并构建表达载体，转化水稻；11. 创制LA1蛋白不同结构域突变的突变体，构建植物表达载体，转化水稻；12. 完成soa突变体的遗传分析及基本生物学特性的分析；13. 构建2-3个SOA基因的遗传作图群体，并对SOA基因进行图位克隆；14. 构建2-3个SOA基因的遗传作图群体，并对SOA基因进行图位克隆；15. 分析LRR-RLKs的时空表达模式；16. 筛选LRR-RLKs的转基因植株和缺失突变体；17. 筛选bak1-3 bkk1-1的遗传抑制子；18. 利用酵母双杂交检验SERKs相互作用；19. 创建CDPK、CIPK类激酶基因缺失突变体；20. 创建CDPK、CIPK类激酶基因过量表达突变体；21. 参加国际会议，邀请该领域的相关专家来实验实进行交流1. 明确rmst1和red1突变体突变体的表型；2. 获得基因型与表型的对应关系，检验是否共分离；每个拟南芥突变体得到3-5个表型回复突变体并鉴定其表型回复程度；3. 明确12个E2的生物学功能4. 初步确定生物学功能并与双子叶植物的相应E2功能比较。5. 鉴定出1-2个特异性组装的26S蛋白酶体亚基。6. 筛选获得可能与目标蛋白相互作用的因子；获得多个LA1的候选相互作用蛋白；7. 分离和鉴定5-10个重要基因；8. 获得拟南芥赤霉素相关的突变体；9. 获得影响DEP1-GFP融合蛋白定位的red突变体；10. 获得DEP1蛋白不同结构域改变的转基因水稻；11. 获得LA1蛋白不同结构域改变的转基因水稻；12. 明确soa突变体在茉莉酸存在下侧根发生情况及PIN蛋白的降解情况；13. 明确soa突变体在茉莉酸存在下侧根发生情况及PIN蛋白的降解情况；14. 明确SOA基因的精细定位；15. 获得LRR-RLKs的时空表达模式；16. 开始获得LRR-RLKs的转基因植株和缺失突变体；17. 开始获得bak1-3 bkk1-1的遗传抑制子；18. 得到SERKs之间的相互作用关系图；19. 获得CDPK、CIPK类激酶基因缺失突变体；20. 获得CDPK、CIPK类激酶基因过量表达突变体；21. 与相关专家进行交流。第二年1. 表达目标蛋白，并获得其多克隆抗体；2. 利用高表达和突变体初步研究第一年度各个课题组所分离鉴定的基因及其编码蛋白的功能；在突变体背景中高表达或敲除编码相互作用的蛋白的基因；3. 初步研究VER2如何影响FLC位点组蛋白修饰；4. 表达目标蛋白，通过体外泛素化实验检测其E3活性；5. 通过GUS染色及GFP荧光观察分析目标基因的时空表达模式；6. 完成 E2与 E3蛋白家族之间特异性分析；7. 建立完整的植物泛素蛋白体外降解体系；8. 构建单，双突变体，研究鉴定出的特异性组装的26S蛋白酶体亚基的功能；9. 筛选影响DELLA蛋白积累及功能的res突变体，并构建遗传作图群体；10. 酵母双杂交筛库筛选DEP1的相互作用蛋白DIP，并利用BiFC方法进行验证；11. 构建2-3个RED基因的遗传作图群体，并开展RED基因的图位克隆工作；12. 分析不同突变DEP1转基因水稻表型及蛋白的细胞定位变化。13. 分析不同LA1突变体蛋白的定位。14. 利用BiFC方法验证LA1与候选互作蛋白的相互作用；同时构建Co-IP植物材料。15. 对SOA基因进行精细定位及测序；同时构建另外2-3个SOA基因的遗传作图群体；16. 继续筛选LRR-RLKs缺失突变体及超表达转基因植物；17. 鉴定LRR-RLKs缺失突变体及超表达转基因植物的表型；18. 继续筛选bak1-3 bkk1-1的遗传抑制子；19. 寻找SERKs之间相互作用的氨基酸位点；20. 构建SERK家族的单基因缺失突变体和多重缺失突变体；21. 开始研究SERKs参与BR及胚胎发生的分子机理；22. 开始进行SERKs调控拟南芥维管组织发育的研究；23. 筛选鉴定与CDPK、CIPK类激酶互作的上下游蛋白因子；24. 开始CDPK、CIPK类激酶基因缺失或过量表达时植物对逆境胁迫响应的表型及生理生化差异分析；25. 寻找与蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它们作用的底物和靶基因；26. 参加国际会议和派研究人员参加蛋白新技术培训，进行国际交流。27. 数据分析，论文撰写。1. 获得该基因的蛋白表达载体；2. 获得相关的转基因植株，对这些基因的功能有初步了解；3. 明确VER2影响FLC位点组蛋白修饰过程中1-2个基因的功能；4. 获得该蛋白的E3活性数据；5. 获得目标基因表达的时空特异性数据及亚细胞定位数据；6. 得到E2与 E3蛋白家族之间特异性相互作用的图谱；7. 得到不同处理条件下植物的泛素化蛋白图谱；8. 初步阐明1-2特异性组装的蛋白酶体亚基的功能；9. 获得多个res突变体；10. 获得多个DIPs候选蛋白；11. 获得RED基因的精细定位；12. 初步确定DEP1蛋白定位的关键结构域。13. 确定LA1蛋白定位的关键结构域。14. 获得1-2个LA1的互作蛋白。15. 获得候选2-3个SOA基因。16. 完成筛选LRR-RLKs缺失突变体及超表达转基因植物；17. 得到LRR-RLKs缺失突变体及超表达转基因植物的表型分析结果；18. 获得bak1-3 bkk1-1的遗传抑制子；19. 获得SERKs之间相互作用的氨基酸位点；20. 获得SERK家族的单基因缺失突变体和多重缺失突变体；21. 明确SERKs之间的相互作用及磷酸化是否依赖于BR；明确SERKs影响胚胎发生的具体部位与时期；22. 明确SERKs是否与BRL1和BRL3相互作用；23. 获得与CDPK、CIPK类激酶互作的上下游蛋白因子；24. 完成CDPK、CIPK类激酶基因缺失或过量表达时植物对逆境胁迫响应的表型及生理生化差异分析；25. 得到与蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它们作用的底物和靶基因；26. 根据国际交流的信息向课题组进行汇报。27. 申请专利，发表2-4篇论文。第三年1. 利用酵母双杂交实验，寻找与目标蛋白相互作用的因子；利用体内pull down的方法验证目标蛋白与互作因子的相互作用；2. 对与相互作用的蛋白进行保守序列分析，并对保守序列进行功能为点的定点突变，构建表达突变体蛋白的转基因植株；研究RING蛋白和其它蛋白的识别位点；3. 研究各个ERAD系统基因之间的相互关系，加深对整个植物ERAD体系的了解；4. 研究ERAD与其他环境胁迫信号转导之间的分子机制，找出其中的关键基因；5. 通过进行突变体及转基因表达的分析，研究基因的功能，并对同一亚组的E3连接酶进行分析。6. 深入了解前两年分离鉴定出的相互作用的蛋白的功能；7. 初步研究F-box类蛋白与水稻株型关系8. RES基因定位及克隆，并进行互补验证；9. 利用Co-IP方法验证DEP1及LA1与互作蛋白的相互作用；构建互作蛋白的植物表达载体，转化水稻；10. 构建SOA基因的转基因拟南芥，并进行功能研究；11. 对另外2-3个SOA基因进行精细定位及测序，及互补验证和转基因研究；12. 对RED基因进行精细定位并测序分析，并构建互补载体，转化水稻；13. 通过生物化学、细胞生物学和转基因研究进一步研究LA1转录后修饰分析；14. 突变DEP1蛋白转基因水稻分析；15. 研究影响LRR-RLKs磷酸化的作用因子；16. 完成SERKs相互作用在BR信号途径中的作用机理研究；17. 完成与CDPK、CIPK类激酶互作的上下游蛋白因子的筛选鉴定；18. 开始进行CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内外磷酸化作用及调节分析；19. 开始对筛选到的bak1-3 bkk1-1遗传抑制子进行深入的分子机理研究；20. 继续研究SERKs参与BR及胚胎发生的分子机理；21. 继续进行SERKs调控拟南芥维管组织发育的研究；22. 利用蛋白质组学如质谱等方法确定蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶表观修饰的位点。23. 数据分析，论文撰写。1. 筛选获得可能与目标蛋白相互作用的因子；体内条件下证明其相互作用的真实性；2. 获得目标蛋白与互作因子的相互作用位点；阐明其中2-3个基因的功能；3. 阐明1-2个ERAD系统基因的作用4. 找到其中的1-2个关键基因；5. 明确2-3个新的E3连接酶的功能。6. 了解其中部分基因的功能及其相互作用的动态变化和生物学效应；7. 初步明确F-box类蛋白与水稻助兴的关系；8. 获得候选RES基因；9. 获得DEP1及LA1的互作蛋白；10. 获得另外2-3个SOA基因；11. 初步阐述SOA基因在茉莉酸与生长素互作调控PIN蛋白内吞和降解的机制；12. 获得候选RED基因；13. 进一步证实LA1的转录后修饰；14. 明确DEP1蛋白各功能域对蛋白定位及其生物学功能影响；15. 明确各种作用因子对LRR-RLKs磷酸化的影响；16. 明确SERKs及其相互作用对BR信号转导途径中的作用机理；17. 获得并验证与CDPK、CIPK类激酶互作的上下游蛋白因子；18. 明确CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内外磷酸化作用及调节分析；19. 初步阐明筛选到的bak1-3 bkk1-1遗传抑制子基因调控细胞死亡的分子机理；20. 获得参与胚胎发生的SERKs相互作用蛋白；21. 获得SERKs调控拟南芥维管组织发育的遗传学证据；22. 确定蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶表观修饰的位点；23. 发表6-8篇论文；24. 申请专利1-2项。第四年1. 体内条件下检测互作因子在目标突变体中的胚胎发育或配子体发育过程中的表达变化情况；2. 通过转基因植株的表型分析检测其表达量的变化是否能够造成胚胎发育或配子体发育相关的表型；3. 将目标突变体与胚胎发育过程中表达的重要基因的marker line杂交，观察marker基因的表达情况；4. 进一步研究ERAD系统的作用机制及各基因间的相互关系。5. 系统深入进行功能位点的突变，系统深入研究其功能及相互作用蛋白的动态变化及生物学效应；6. 通过系统的分子和生物化学分析研究F-box蛋白DOR作用的分子机理；深入研究F-box类蛋白初调控水稻株型的机理；研究F-box类蛋白与种子发育的关系；7. 研究VER2通过影响FLC位点组蛋白修饰进而调控拟南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制。8. 利用转基因植物初步分析RES基因对DELLA积累及稳定性的影响；9. 通过对转基因植物分析DIP对DEP1定位的影响；10. 对克隆到的3-5个SOA基因进行系统的功能性研究；11. 系统分析RED基因功能；12. 分析LA1转录后修饰对LA1与互作蛋白的结合以及对LA1在细胞内定位的作用。13. 继续对SERKs调控拟南芥维管组织发育的研究；14. 继续CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内外磷酸化作用及调节分析；15. 继续对筛选到的bak1-3 bkk1-1遗传抑制子进行深入的分子机理研究；16. 继续研究SERKs参与调控BR及胚胎发生的分子机理；17. 通过遗传和细胞生物学手段，阐明蛋白质精氨酸甲基化和组蛋白甲基化动态修饰在开花发育中的作用18. 数据分析，论文撰写。1. 获得相互作用蛋白的缺失或过表达的表型数据，检验是否与胚胎发育或者配子体发育相关；2. 获得目标突变体与相关marker line杂交的数据；3. 得到marker基因的表达数据；4. 深入阐明2-3个ERAD系统中基因的相互作用关系。5. 完成功能位点的突变，系统阐明其功能及相互作用蛋白的动态变化及生物学效应；6. 初步阐明F-box蛋白DOR作用的分子机理；了解F-box类蛋白初调控水稻株型的机理；7. 初步阐明VER2通过影响FLC位点组蛋白修饰进而调控拟南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制；8. 初步阐明RES基因在GA信号途径中的位置及功能；9. 阐明DIP与DEP1相互作用调控水稻穗粒数和产量的机制；10. 阐明SOA基因在茉莉酸调控PIN蛋白内吞和降解的分子调控系统中的作用；11. 明确RED基因功能，及其对DEP1定位的影响；12. 明确LA1转录后修饰对LA1定位及功能的影响。13. 完成SERKs调控拟南芥维管组织发育的研究；14. 完成CDPK、CIPK类激酶对下游蛋白因子的体内外磷酸化作用及调节分析；15. 深入阐明筛选到的bak1-3 bkk1-1遗传抑制子基因调控细胞死亡的分子机理；16. 获得胚胎发生标记基因在serks胚胎发育突变体中的表达模式；17. 明确蛋白质精氨酸甲基化和组蛋白甲基化动态修饰在开花发育中的作用；18. 发表6-8篇论文。第五年1. 通过体外泛素化实验验证目标蛋白是否能够泛素化筛选出的相互作用因子；2. 结合已有的生化结果及目标突变体与marker line杂交的结果，推断目标蛋白可能的作用机制； 3. 研究F-box蛋白调控植物育性的分子及生化机制；4. 研究植物细胞内的O-GlcNAc信号及其与春化响应表观遗传机制之间的关系；探讨蛋白的O-GlcNAc修饰对春化相关蛋白活性的调控机制；深入研究拟南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制；5. 探讨拟南芥干旱胁迫和生物胁迫的分子机制；6. 研究DEP1蛋白在细胞膜-细胞核穿梭和定位的调控机制；7. 利用前面获得的材料和实验系统，详细解析LA1运输、定位及功能；8. 综合运用分子遗传学、生物化学、细胞生物学等多种手段对克隆到的SOA基因进行系统的功能性研究；9. 系统解析RES基因的功能；10. 完成对筛选到的bak1-3 bkk1-1遗传抑制子的分子机理研究；11. 完成SERKs参与BR及胚胎发生的分子机理的研究；12. 组织一个“Protein modification and plant development”小型国际会议；13. 数据整理，论文撰写。14. 评估其中若干个基因的应用价值；1. 获得相互作用因子在体外被该蛋白泛素化并降解的数据；2. 推断目标蛋白介导的蛋白泛素化修饰调控胚胎发育及配子体发育的作用机制。3. 了解F-box蛋白调控水稻株型及发育性状的分子调控机制；阐明SCFCOI1泛素连接酶复合体介导的植物雄性不育等生长发育过程的分子机制；4. 阐明VER2通过影响FLC位点组蛋白修饰进而调控拟南芥春化响应及开花时间的分子及生化机制5. 阐明F-box蛋白DOR作用的分子机理，进一步探讨拟南芥干旱胁迫的分子机制，为利用该基因提高植物抗旱性提供理论依据；6. 阐释DEP1控制水稻穗粒数和提高产量的分子机制；7. 进一步明确LA1在细胞核与细胞膜间穿梭控制水稻生长素运输及水稻分蘖数的分子调控网络；8. 揭示SOA基因参与PIN蛋白内吞和降解的分子调控及其作用机理；9. 明确RES基因参与赤霉素信号途径的分子机制；10. 最终阐明SERKs参与调控BR及胚胎发生的分子机理；11. 明确SERKs通过特异磷酸化调控多条信号通路的分子机理；12. 进行国际交流13. 发表7-10篇论文；14. 申请专利3-5项；15. 累计培养博士后20名，博士生60名。一、研究内容目前，尽管国内外对植物系统中蛋白质加工、修饰与动态变化进行了广泛的研究，在资源收集、生理生化以及基因克隆和遗传转化等方面已经取得了重要的进展，但是对与植物分子生物学和遗传学密切相关的关键科学问题，特别是植物系统中蛋白质加工、修饰与动态变化的调控及上游信号传递的了解不够深入，极大地限制了我们的深入认知。本项目拟将植物蛋白质加工、修饰与动态变化的遗传学与分子生物学研究相互结合、优势互补，以解析主效基因的功能为主要研究线索，以上游信号传递及作用机制研究为突破口，对植物蛋白质加工、修饰与动态变化的机制进行系统的研究。主要研究内容包括：1. 植物蛋白修饰的重要过程与调控机理；2. 植物蛋白泛素化降解调控的分子机理；3. 植物细胞内蛋白质运输与定位的动态变化机制；4. 蛋白修饰和降解调控植物生长发育的分子机制。1、植物蛋白的重要修饰过程与调控机理本项目将围绕植物蛋白质的磷酸化、甲基化、糖基化等重要修饰形式，研究相关修饰的重要过程、调控机理及生物学功能。根据植物蛋白修饰的共性和特异性将研究分为两个大的方面：（a）植物细胞重要功能蛋白磷酸化的作用及调控机理。蛋白磷酸化在植物信号的接受和传导中起重要的调控作用。将着重研究受体类激酶（Receptor -LikeKinases，RLKs）和钙信使感受器（Ca2+ Sensors）及其下游调控因子。本课题拟解决的关键科学问题：(1) LRR-RLKs在调节植物生长发育及响应环境胁迫过程中的生物学功能；(2) CDPK和CIPK两个家族中部分成员在植物响应非生物逆境（干旱、高盐、营养亏缺等）胁迫过程中的功能和作用及分子调控机理。（b）植物蛋白甲基化和蛋白糖基化的机理与作用。这方面将着重研究植物的甲基化和蛋白糖基化修饰与动物的共性及植物的特异性机制及功能。各种蛋白质翻译后修饰对植物开花发育的分子机制的影响目前研究得仍处于起步阶段。拟以模式植物拟南芥为材料，重点研究蛋白质精氨酸甲基化和组蛋白去甲基化在调控植物开花发育中的作用及其机制。主要研究内容包括：1) LRR-RLKs的磷酸化如何受体内外各种因子的调控；通过分析超表达、T-DNA插入突变体及显性负调控突变体来揭示LRR-RLKs 的生物学功能；SERKs（LRR-RLKs的一亚类）通过特异性磷酸化来激活多条信号途径的分子机理。2) CDPK、CIPK类激酶植物对逆境胁迫响应的表型及生理生化差异分析；与CDPK、CIPK类激酶互作的上、下游蛋白因子的筛选鉴定；对下游蛋白因子的体内、外磷酸化作用及调节分析；构建通过CDPK、CIPK类激酶磷酸化调控植物响应逆境胁迫的分子调控网络模型。3) 寻找与蛋白质精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它们作用的底物和靶基因；利用蛋白质组学如质谱等方法确定这些表观修饰的位点；通过遗传和细胞生物学手段，阐明蛋白质精氨酸甲基化和组蛋白甲基化动态修饰在开花发育中的作用。2、植物蛋白泛素化降解调控的分子机理信号转导是生物学的重大研究课题，泛素/蛋白酶复合体（Ubiquitin/26S proteasome）介导的蛋白降解信号转导途径的研究是近年基础生物学研究的前沿领域。前期的研究证明利用植物系统易于进行遗传学操作的特点进行泛素化调控机制的研究可推动人类的相关研究。尽管国内外对泛素介导的蛋白降解途径进行了广泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已经取得了重要的进展，但是关于泛素蛋白降解机制及其参与植物正常生长发育和植物抵抗逆境胁迫的作用机制的研究刚刚起步，特别是对泛素蛋白在植物整个生命活动中起的调节作用的了解不够深入，因而极大地限制了通过基