WB实验常见问题与解决方案讲座

报告人 南京巴傲得质检部负责人沈健 Westernblot常见问题及对策 一 WB基本原理的理解 蛋白质印迹的发明者 一般认为是上个世纪是美国斯坦福大学的乔治 斯塔克 GeorgeStark 蛋白质印迹法 免疫印迹试验 即WesternBlot 首次在尼尔 伯奈特 NealBurnette 于1981年所著的 分析生物化学 AnalyticalBiochemistry 中首次被称为WesternBlot 应用 广泛用于检测蛋白水平的表达 蛋白质印迹法 免疫印迹试验 即WesternBlot的起源 WesternBlot WB 原理 一 WB基本原理的理解 通过电泳区分不同组分 并转移至固相支持物 通过特异性试剂 抗体 作为探针 对靶物质进行检测 蛋白质的WESTERN印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点 可检测到低至1 5ng 最低可到10 100pg 中等大小的靶蛋白 一 WB基本原理的理解 WB基本原理示意图 红色箭头 目标抗原绿色箭头 靶抗体黄色箭头 标记二抗 一 WB基本原理的理解 WB基本过程示意图 WB样本来源 大部分细胞或组织裂解物 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 Triton X100 NP 40 SDS和脱氧胆酸钠 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 样本中蛋白酶抑制剂的使用 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 样本浓度的测定 根据待测蛋白状态确定电泳条件 二 样本的制备和抗体的选择 样本制备 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 一抗的种属来源 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔 一抗的选择应与你现有的二抗相匹配 例如 如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体 二抗则选抗小鼠的二抗 山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔单抗 则相应的二抗需要选择抗兔的二抗 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 一抗属于哪个类或亚类 针对单克隆抗体 除了要与一抗的种属来源相一致 二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配 单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述 如果您的一抗是小鼠IgM 那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体 如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合 或者您也可选择专门针对这一亚类的二抗 例如 如果您的一抗是小鼠IgG1 那么您可以选择抗IgG1的二抗 此种抗体在双标记实验中尤其适合 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 二抗的种属来源 不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系 主要应用 双标实验里例如 如果其中一个一抗是山羊来源的 一个是小鼠来源的 则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗 这时候 二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的 有相应的驴来源的二抗 非常适合做类似双标的免疫实验 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 抗体的偶联标记 一般来讲 耦联到二抗上的探针主要有酶 辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP PAP 荧光基团 FITC Rhodamine TexasRed PE Rhodamine Dylight等 生物素 金颗粒 WesternBlot实验中主要用酶标二抗 HRP和AP或其衍生物APAAP PAP标记 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 抗体的交叉反应 交叉反应 有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应 例如 你想做人和大鼠的实验 那么就希望买的抗体可以同时针对人和大鼠 相反如果有人只做一个种属的试验 那么可能就希望抗体的特异性更高点 那么就和其他种属的交叉反应越少越好 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 蛋白名称 多抗 Pan 不专一性的 比如蛋白质有isoform a b c等 Pan抗体会和所有的 至少多于一个识别 mAb 单抗 P641 多肽免疫原的免疫原位置 对应个蛋白uniprot号中蛋白序列的位置 C67E7 单抗的对应克隆号 HRPConjugate 抗体直接标记HRP 5A1E 单克隆抗体的克隆号 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 例如 CleavedCaspase 3 Asp175 5A1E RabbitmAb 9664 备注 pro caspase 3在活化过程中从Asp28 Ser29Asp175 Ser176两处被剪 形成P17 29 175 和P10 182 277 两个片段 注意 检测数据以抗体的datasheet为准 二 样本的制备和抗体的选择 抗体的选择 WB检测的缺陷 直观上只能从分子量的大小来来判断结果的准确性 抗体的datasheet尤为重要 如果对于抗体的检测有以下样本来辅助说明 那可以放心使用 1 干扰样本的检测 2 敲除样本的检测 3 过表达的突变样本 4 其他 三 WB检测过程中关键截点的判断 各种参数 样本 抗体 转膜 洗膜 显色 电泳 其他 WB检测结果 三 WB检测过程中关键截点的判断 样本 三 WB检测过程中关键截点的判断 转膜 转膜效率的判断 1 膜上蛋白mark的转移情况 初步 2 转膜后胶上残留蛋白的检测 SDS PAGE的确认 3 转膜后丽春红染色的情况 最直观 4 转膜后 膜上对应内参的检测 5 转膜第一张 转膜第二张 转膜残留胶 分离胶浓度 12 转膜条件 稳流 350mA 100min PVDF 0 45 三 WB检测过程中关键截点的判断 转膜 在现有的转膜体系下 每一个分子量的蛋白都会有最合适的转膜效率 条件越强 胶上残留的越少 透过率就更多 留在膜上的蛋白就有一个最优的条件 以下是对于0 45的PVDF膜 三 WB检测过程中关键截点的判断 转膜 三 WB检测过程中关键截点的判断 WB检测体系 WB检测过程中 内参的结果可以表明基本的WB过程和试剂没有问题 例如 在我们Bioworld进行WB检测过程中 一般内参的全细胞上样量10微克 内参1 5000 二抗 1 5000 曝光10 30s能有比较好的显色条带 解决 重新按照SOP 认真准备样本 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 样本问题 123456 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 样本问题 问题 内参和某些靶蛋白条带没有解决 考虑药物处理的影响 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 样本问题 一抗的检测 问题 蛋白浓度太高或者盐浓度太高 解决 稀释样本 减少上样量或者降低盐浓度 一抗的检测 Westernblot WB analysisofEGFR phospho Y1086 pAb BS4706 at1 500dilution Lane1 Helawholecelllysate 40ug Lane2 HelatreatedwithH2O2 100nmol ml 28min wholecelllysate 40ug Lane3 HelatreatedwithH2O2 100nmol ml 28min ppase wholecelllysate 40ug 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 样本问题 问题 药物刺激或者建模有没有成功 解决 寻找合适的阳性样本和阳性抗体对照 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 转膜问题 问题 转膜强度不够 跑胶程度不够 解决 增强转膜强度 时间和电流 合适的胶浓度跑久一点 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 转膜问题 问题 转膜强度太强 导致目的位置上方的杂带太强解决 降低转膜强度 时间和电流 使目标蛋白上方的蛋白少转移到膜上 问题 泳道部分弯曲 解决 可能是电泳槽问题 可能是8 以下的分离胶造成胶乱 转膜时 胶被扭曲 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 胶的问题 问题 转膜气泡 解决 制作三明治的时候注意 不在目的位置不影响 在目的位置只能重新做 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 转膜问题 解决 转膜过程中 三明治制作仔细一点 转膜缓冲液没过转膜三明治 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 转膜问题 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 二抗选择问题 问题 二抗选择问题 解决 如果这种按膜还在 没有干过 用1XTBST洗涤5 X3次 然后从封闭开始 重新WB接下去的步骤 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 抗体稀释度 问题 杂带多 背景大 解决 降低上样量 增加一抗的稀释比 1 4 humancell5 mousecell6 Ratcell 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 种属特异性 问题 大小鼠种属检测不到条带或者条带很弱 解决 更换抗体 或者通过降低一抗稀释比和上样量等方法 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 趋势问题 问题 抗体效价太高 趋势分不清解决 增加一抗的稀释比 1 5000 内参 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 抗体一起孵育 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 胶片曝光 问题 胶片曝光 解决 解决唯一的办法换没有曝光个的胶片 提前去掉曝光的胶片 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 ECL液的选择 BS7004 问题 显色条带弱 解决 可以选择超敏的发光液进行显色 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 曝光问题 问题 条带中间显白 解决 增加ECL的稀释度 减少上样量 增加一抗的稀释度 同一张膜上 相同的两个重复结果 ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 3s 120s 120s ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 3s 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 ECL液问题 普通ECL液超敏ECL液 问题 ECL显色过程中荧光淬灭过快 解决 根据ECL液的特性 尽快选择显色 有些ECL液需要混匀孵育几分钟后才能达到最优的效果 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 曝光仪器的问题 同一张膜先后在不同的曝光仪器上曝光的结果 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 凝胶问题 问题 胶上mark分布不合理 解决 胶没有制好 很大程度是胶没有混匀 重新制胶 12 的分离胶 12 的分离胶 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 条带粘连 问题 条带粘连 解决 上样量太多 减少上样量 制胶问题 分离胶和浓缩胶之间有间隙 样品窜孔 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 分子量问题 问题 mark条带有误差 解决 mark本身批次间的差异 跑胶程度和分离胶浓度不同 不同厂家的Mark间的差异等 选择知名的mark厂家 mark条带作为参考 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 图片处理 问题 条带太多 解决 调整图片的亮度对比度 四 WB检测过程中常见问题的分析和解决方案 曝光时间 3S120S