实验六、反相高效液相色谱法测定尼泊金甲酯.doc

实验六、反相高效液相色谱法测定尼泊金甲酯1、 实验目的1、了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作。2、了解反相色谱法的基本原理，掌握反相色谱法分离尼泊金甲酯的方法。3、掌握利用内标法进行色谱定量分析的实验方法。2、 实验原理1、对羟基苯甲酸甲酯，又叫尼泊金甲酯，结构式：白色结晶粉末或无色结晶，易溶于醇，醚和丙酮，极微溶于水，沸点270-280。主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂。 由于它具有酚羟基结构，所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强。其作用机制是：破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，并可抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性。2、高效液相色谱高效液相色谱是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。他是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱理论，在技术上采用高压输压泵、梯度洗脱技术、新型高效填充剂及各种高灵敏度监测器。高效液相色谱与气相色谱比较，可供选择的流动相种类较多，从有机溶剂到水溶剂，既能用纯溶剂又可用二元或多元混合溶剂，并可任意调配比例，通过改变溶剂极性或强度继而改变色谱柱效能、分离选择性和组分的容量因子，最后实现改善色谱系统分离度的目的。3、高效液相色谱法的特点：1）分析速度快。2）离效率高。3）灵敏度高、易于实现操作自动化。4）适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。4、高效液相色谱仪流程示意图：5、 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：6、定性方法：1）利用纯物质定性的方法1 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。2 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。（2）利用文献保留值定性7、常用的几种定量方法（1）归一化法：若试样中含有n个组分，且各组分均能洗出色谱峰，则其中某个组分的质量可按下式计算 归一法特点及要求：1 归一化法简便、准确；2 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；3 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。（2）内标法：在一定试样中加入一定量的内标物，根据待测组分和内标物的峰面积及物质量计算待测物质质量的方法。 内标物要满足以下要求：1 试样中不含有该物质；2 与被测组分性质比较接近；3 不与试样发生化学反应；4 出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS计算式：内标法特点1 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。2 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。3 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：（3） 外标法：外标法也称为标准曲线法。特点及要求： 1 外标法不使用校正因子，准确性较高;2 操作条件变化对结果准确性影响较大;3 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。3、 实验仪器与试剂1、色谱仪：Agilent 11002、色谱柱：C18柱， 250 mm4.6 mm，柱长：75mm3、流动相：甲醇:水(70:30)，流速：1.0 mL/min4、检测器：紫外检测器 254 nm 四、实验基本操作1、打开电脑主机，再打开高效液相色谱的模块，启动工作站并初始化仪器。2、仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：流动相组成=甲醇:水(70:30) ，流速=1.0 mL/min ，柱压=200 kPa。3、运行程序，清洗色谱柱，直至基线平稳，然后进样，进行测定。4、测定结束后，依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟，退出主程序，关闭计算机。五、实验步骤1、确定实验条件（流动相、流速、检测波长等）2、溶液的配制：以流动相为溶剂，表样储备液（0.10mgmL-1）为原液配置浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mgmL-1的标准溶液。3、 标准曲线制作：待仪器稳定后，依次进样20L已知溶液，记录色谱图及保留时间tR。4、样品分析：注入20L未知液，记录色谱图及各组分保留时间tR。六、实验数据分析 1、表一：一系列尼泊金甲酯标准溶液保留时间及其峰面积：浓度（mgmL-1）保留时间（min）峰面积0.021041061081101根据表一中数据制得尼泊金甲酯的标准曲线图：图中由于0.1mgmL-1尼泊金甲酯溶液所测得的峰面积数据有问题，故舍弃。2、以下是分离未知样品所得色谱图：根据分离未知液所得色谱图及表一中的数据可知，保留时间为1.175min的峰是尼泊金甲酯的峰，峰面积为8180844v/s，由测得的峰面积在标准曲线上可求出被测组分尼泊金甲酯的浓度为0.0665mg/mL。七、实验注意事项及总结1、标准曲线的测定过程中，测定溶液的浓度要从小到大变化，这样可以避免大浓度溶液对小浓度溶液的影响，且操作起来较方便。2、配制系列标准溶液的时候，因为配制溶液的总体积较小，因此要用微量移液枪进行移液。但实验中因为只有100g的移液枪，量比较小，因此误差有点大。3、进样的时