异丙酚对肺动脉平滑肌细胞钾电流的影响(摘要).doc

异丙酚对肺动脉平滑肌细胞钾电流的影响（摘要）解放军总医院麻醉科 （100853）姜雨鸽 徐龙河 张 宏目的：观察异丙酚对正常血压及肺动脉高压大鼠动脉平滑肌钾通道的影响。方法： SD大鼠，建立肺动脉高压大鼠模型。急性分离大鼠肺内动脉平滑肌细胞。用膜片钳全细胞记录技术记录细胞钾电流，电流经膜片钳放大器（EPC-9，德国HEKA）后，输入微机，用Pulse+ Pulsefit 软件(8.31版，德国HEKA)采样。形成千兆欧姆封接破膜后，以-70mV钳制电位，给予从-60 mV至+50 mV（步幅为10 mV）的方波刺激，持续时间为150ms。通过浴槽内给药，观察异丙酚对钾电流的影响。结果：慢性缺氧6周后，测量大鼠平均肺动脉压(MPAP)，模型组大鼠MPAP显著高于对照组（P0.01）。异丙酚对正常大鼠肺动脉平滑肌细胞钾电流的作用：异丙酚在 50molL-1浓度下，15例细胞中有7例出现对钾电流的增强作用，阳性细胞反应率为47%,给药后五分钟内细胞钾电流的平均幅值增加为给药前的(120.7 10.8)%；异丙酚在100molL-1浓度下，11例细胞中有8例出现对钾电流的增强作用，阳性细胞反应率为72.7%，给药后五分钟内细胞钾电流的平均幅值为给药前的(112.9 5.0)%。在相同条件下，给予吡那地尔100molL-1后，7例细胞中有7例对钾电流有增强作用，阳性细胞发生率为100%,给药后五分钟内细胞钾电流的平均幅值增加为给药前的(156.3 30.9)%。同时间溶媒对照组细胞钾电流平均幅值下降为初始电流的（61.8 6.1）%。异丙酚对肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞钾电流的作用：异丙酚在50molL-1浓度下， 12例细胞中有8例出现对钾电流的增强作用，阳性细胞反应率为67%,给药后五分钟内细胞钾电流的平均幅值增加为给药前的（125.5 5.2）%；异丙酚在100molL-1浓度下，8例细胞中有6例出现对钾电流的增强作用，阳性细胞反应率为75%,给药后五分钟内细胞钾电流的平均幅值增加为给药前的（122.2 7.6）%。在相同条件下给予吡那地尔100 molL-1后，6例细胞中有6例对钾电流有增强作用，阳性细胞发生率为100%,给药后五分钟内细胞钾电流的幅值增加为给药前的（125.6 15.8）%，同时间溶媒对照组细胞钾电流幅值下降为初始电流的（80.8 56.2）%，n = 6。1、3、5分钟时各浓度给药组细胞钾电流I-v曲线与溶媒对照组相比较均明显上移。结论：本研究显示表明异丙酚可以增强正常大鼠和肺性高血压大鼠动脉平滑肌细胞外向钾电流，提示异丙酚舒张肺血管的机理和钾通道开放有关。异丙酚对肺动脉平滑肌细胞钾电流的影响肺动脉高压（PAH）可有许多不同疾病引起，对于并发PAH的手术病人麻醉诱导及维持的重要环节是维持循环功能的稳定，防止肺动脉压的进一步升高。一些离体实验研究显示，异丙酚可以引起肺血管舒张，肺血管阻力降低1,2，异丙酚引起肺血管舒张的机制尚不明确。越来越多的证据表明K+通道在调节肺血管张力中起重要作用3。本研究模仿病理条件下的缺氧过程而构建肺动脉高压模型，拟评价异丙酚对正常血压大鼠及肺动脉高压大鼠动脉平滑肌K+通道电流的影响。材料与方法动物分组 14只SD大鼠，军事医学科学院实验动物中心提供，雄性，体重19010g，随即分为正常对照组和肺动脉高压模型组。肺动脉高压大鼠模型的建立及鉴定4，将大鼠置于常压缺氧（10%O2）舱内，每天h，每周d，持续w。大鼠用1%戊巴比妥钠(50mg#kg-1)腹腔内注射麻醉后，经右侧颈外静脉插入PE50聚乙烯导管至肺动脉,采用多道生理仪（RM-6200C）测定平均肺动脉压(MPAP)。若肺动脉压高于正常大鼠的25，模型建立成功。结果：慢性缺氧6w后，模型组大鼠MPAP 5.91.0kPa显著高于对照组2.70.1kPa（P0.01），说明肺动脉高压模型成功。肺动脉平滑肌细胞分离 按照参考文献5加以改进。将大鼠断头处死，迅速取出肺脏，置于4 生理盐水溶液中，分离1、2级小动脉分支，经修饰后沿纵轴剪开，去除内皮，将动脉剪成1 mm2大小，置于37 无钙液中温孵2030min，然后放入低钙酶液中，37 温孵消化58min，用低钙液洗涤23次终止消化，用管口平滑的吸管吹打释放细胞并缓慢复钙至0.6 mmol.L-1，得到平滑肌细胞。全细胞记录 用全细胞记录技术记录细胞电流。取分离好的细胞悬液加入灌流槽中，静置10min使细胞贴壁后，用无钾外液灌流，速度为2mlmin-1。选取细胞膜光滑完整、长梭型的细胞进行实验。记录方法：电极充灌内液后入水，调节三维操纵器使电极尖 端移向细胞表面进行封接，阻抗达到2G以上后 补偿快电容，并给予负压破膜形成全细胞记录模式。电流信号由与计算机相连的膜片钳放大器(EPC-9，德国HEKA)放大,信号的发放和采集均由Pulse+ Pulsefit (8.31版，德国HEKA)软件完成。刺激参数：以-70mV钳制电位，给予从-60 mV至+50 mV（步幅为10 mV）的方波刺激，持续时间为150ms。电极内液（mmolL-1）：KCl140、EGTA10、HEPES10用KOH调节PH至7.27.4。细胞外液（mmolL-1）：NaCl140、MgCl2 1.0、KCl5.0、 HEPES 10、Glucose10、CaCl23，用NaOH调节PH至7.3。正常大鼠和肺动脉高压大鼠平滑肌细胞均给予50和100 molL-1的异丙酚（CW832，AstraZeneca生产，意大利），阳性对照采用100 molL-1吡那地尔（Sigma公司,美国），阴性对照为同时间溶媒。于封接破膜形成全细胞记录后第一分钟在浴槽内给予不同浓度的异丙酚，动态记录给药后1、3、5min时各给药组对正常大鼠和肺动脉高压大鼠K通道电流幅度的影响，以给药前记录的K通道电流为100%。对K通道电流有增强作用的细胞占记录细胞总数的百分比为阳性细胞反映率。统计学处理 用Pulse+pulsefit8.31及Igorpro软件进行曲线测量、处理,曲线拟合由Origin 6.0软件完成。采用SAS6.0软件进行统计学处理，所有数据均用均数标准差表示，组间比较采用t检验、组内比较采用方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。结 果1 K通道电流的测定 使用正常的电极内液和细胞外液，形成全细胞记录后激活一外向电流。将电极内液中的KCl（140mmolL-1）以相同浓度的CsCl替代，并在外液中加入10mmolL-1的钾通道阻断剂TEA可有效阻断上述条件下记录的外向电流，恢复电极内液中的钾离子浓度，电流被重新诱发。说明该条件下方波刺激诱导的外向电流为K通道电流。见图1。B3 异丙酚对正常大鼠肺动脉平滑肌细胞K通道电流的作用给予不同浓度的异丙酚以及阳性和阴性对照后，正常大鼠肺动脉平滑肌细胞阳性细胞反应率、给药后5min内细胞K通道电流的平均幅值见表1。1、3、5min时各浓度给药组细胞K通道电流I-V 曲线与溶媒对照组相比均明显上移（图2a,b）。4 异丙酚对肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞钾K通道电流的作用给予50和100 molL-1的异丙酚以及阳性和阴性对照后，肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞阳性细胞反应率、给药后5min内细胞K通道电流的平均幅值见表2。1、3、5min时各浓度给药组细胞K通道电流I-V曲线与溶媒对照组相比较均明显上移（图2 c,d）。讨 论根据文献6 50和100 molL-1异丙酚相当于临床浓度的12倍，因此我们选择这两个浓度研究。临床上，异丙酚起效迅速约30s， 作用时间短，分布半衰期24min，因此实验中给药后观察时点定为1、3、5min。近年来,人们认识到,在影响血管张力的各种综合因素中,来自血管平滑肌细胞内在的电生理活动发挥着十分重要的作用7。如钾通道的开放,促使细胞膜电位增加,细胞膜超极化,从而使血管平滑肌兴奋性下降,血管张力降低;反之,钾通道的关闭,则使血管张力增加。异丙酚可引起动脉平滑肌细胞膜超极化,从而降低平滑肌细胞的兴奋性8。这种超极化是与异丙酚激活钙离子敏感性钾通道有关9，导致血管平滑肌的紧张性降低，血管舒张。我们的研究显示，给予50和100 molL-1异丙酚后，正常大鼠和肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞K通道电流的平均幅值均明显增高（P0.01），I-V曲线与溶媒对照组相比较均明显上移（P0.01），说明异丙酚对正常大鼠和肺性高血压大鼠动脉平滑肌细胞外向K+通道电流均有增强作用。这可能是其降低肺血管张力，舒张肺血管的机制之一。最近的研究显示 10，肺动脉平滑肌细胞钾离子通道活性降低在缺氧性肺动脉高压发病中起重要作用，钾通道开放剂可望达到低肺动脉压和防止肺血管重构的目的。我们的结果提示异丙酚通过使肺动脉血管平滑肌K+通道电流开放，降低肺血管张力，对肺动脉高压病人可能是有利的。有临床研究也证实异丙酚可安全用于合并肺动脉高压病人的麻醉11。但是，也有研究表明12，异丙酚麻醉诱导时肺血管阻力增高36，在麻醉维持期肺血管阻力可恢复到诱导前水平。药物的体肺循环效应是它们对中枢神经系统、循环血中儿茶酚胺含量、心肌收缩力和末梢（体、肺）血管直接作用的综合反应，这可能是离体研究和在体研究结果不一致的原因。总之，本研究显示表明异丙酚可以增强正常大鼠和肺性高血压大鼠动脉平滑肌细胞外向K+ 通道电流，这可能是其降低肺血管张力，舒张肺血管的机制之一。参考文献1 Park WK, Lynch C 3rd, Johns RA. Effects of propofol and thiopental in isolated rat aorta and pulmonary artery.Anesthesiology,1992,77:956-963.2 Rich GF, Roos CM, Anderson SM,et al. Direct effects of intravenous anesthetics on pulmonary vascular resistance in the isolated rat lung. Anesth Analg,1994,78:961-966.3 钱金桥,杨炎华,周定邦等. 缺氧性肺血管收缩的细胞机制. 医学综述,2005, 11:307-309.4 Jeffery TK, Bryan-Lluka LJ, Wanstall JC. Specific uptake of 5-hydroxytryptamine is reduced in lungs from hypoxic pulmonary hypertensive rats .Eur J Pharmacol, 2000, 396:137-140.5 Cox RH, Petrou S. Ca2+ influx inhibits voltage-dependent and augments Ca2+-dependent K+ currents in arterial myocytes. Am J Physiol,1999, 277:C51-63.6 Cruz JP,Sedeno G,Carmona JA,et al. The in vitro effects of propofol tissular oxidative stress in the rat. Anesth Analg,1998,87:1141-1146.7 Mistry DK, Garland CJ. Nitric oxide(NO)-induced activation of conductance Ca2+-dependent K+ channel(BKca) in smooth muscle cells isolated from the rat mesenteric artery. Br J Pharmacol, 1998,124:1131-1140.8 Yamazaki M, Nagakawa T, Hatakeyama N et al.The effects of propofol on neural and endothelial control of in situ rat mesenteric vascular smooth muscle transmembrane potentials. Anesth Analg, 2002,94:892-897.9 Klockgether-Radke AP, Schulze H, Neumann P, et al.Activation of the K channel BK(Ca) is involved in the relaxing effect of propofol on coronary arteries. Eur J Anaesthesiol,2004 ,21:226-230.10 沈红,王虹,杨玉.钾通道在肺动脉高压中的作用. 国外医学呼吸系统分册,2003,23: 180-182.11 容俊芳，张志刚，高丽君等.静脉麻醉药对先心病合并肺动脉高压病人肺循环阻力的影响. 中华麻醉学杂志，2003,23:740-742.12 Claeys MA, Gepts E, Camu F. Haemodynamic changes during anaesthesia induced and maintained with propofol.Br J Anaesth,1988, 60:3-9. B图1 平滑肌细胞K通道电流的全细胞纪录，膜电位钳制于-70 mv，给予步幅为10 mv的去极化刺激至+50 mv，持续时间为100 ms A:使用正常电极内液和细胞外液,去极化刺激可诱发一系列外向K通道电流，该电流具有时间与电压依赖性以及延迟整流特性，几乎不失活；B: 将电极内液中的KCl（140 mmol.L-1）以相同浓度CSCl替代，并在细胞外液中加入TEA（10 mmol.L-1）后，去极化刺激不能诱发细胞外向K通道电流. 图2 异丙酚对正常及肺性高血压