大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变.doc

基因组学与应用生物学，2011 年，第 30 卷，第 5 期，第 556-563 页Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.5, 556-563研究报告A Letter大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变周兴 1,2韦星明 2杨祥开 2郑元涛 2庞浩 3许黎明 2黄日波 1,3*1 广西大学生命科学与技术学院, 南宁, 530005; 2 广西科学院生物研究所, 南宁, 530007; 3 生物质能源酶解技术国家重点实验室, 广西科学院,南宁, 530007* 通讯作者, 摘 要大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖，具有一个可能控制产物特异性的 325RLDRD329 基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变，共构建R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析，结果显示所构建突变体的 Km 值上升约 25 倍，比活力下降至野生型 SI 比活力的 11.8%25.3%。HPLC 分析显示 Arg325 和 Arg328 分别突变为 Asp，导致产物中异麦芽酮糖 / 海藻酮糖的比例从 6.93 分别降至 0.96 和2.92，并伴随一个未知寡糖出现。Arg328 突变为 Ala 和 Gln 同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升，异麦芽酮 糖比例下降。但是突变体 D329N 反应产物比例没有变化。以上结果表明 325RLDRD329 基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用，并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。关键词 蔗糖异构酶, 定点突变, 产物特异性, 大黄欧文氏菌Site-directed Mutation in a Product-Specificity-Controlling Motif of SucroseIsomerase from Erwinia rhaponticiZhou Xing 1,2Wei Xingming 2Yang Xiangkai 2Zheng Yuantao 2Pang Hao 3Xu Liming 2Huang Ribo 1,3*1 College of Life Science and Biotechnology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 Biology Institute, Guangxi Academy of Sciences, Nanning,530007; 3 State Key Laboratory for Biomass & Enzyme Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, 530007* Corresponding author, DOI: 10.3969/gab.030.000556Abstract Sucrose isomerase (SI) from Erwinia rhapontici isomerizes surcose to produce isomaltulose and tre-halulose. It has a motif (325RLDRD329) which may control the product specificity. In this study, the charged amino acid residues of the motif have been site-directedly mutated, and 5 mutants (R325D, R328A, R328D, R328Q and D329N) were obtained. By analyzing the enzymatic characteristics of the mutants and the product composition of sucrose conversion catalysed by the mutants, we found that the Km of these mutants increased by about 25 folds and the specific activity decreased to 11.8% 25.3% that of wild-type enzyme. The replacement of residues Arg325 and Arg328 respectively to residue Asp resulted in a decrease of the isomaltulose/trehalulose ratio from 6.93 to 0.96 and2.92 respectively in the reaction products and the emergence of an undetermined oligosaccharide by HPLC assay. Mutation of residue Arg328 with Ala and Gln respectively also increased the percentage of trehalulose and reduced the percentage of isomaltulose in the sucrose converted product. However, the ratio of isomaltulose/trehalulose for- mation by D329N mutant was similar to that of wild-type enzyme. Based on our results, we believe that the 325RL- DRD329 motif is essential for the activity of SI from E. rhapontici and also affects the product specificity of this en- zyme. Our results will provide a foundation for understanding the mechanism of SI.Keywords Sucrose isomerase, Site-directed mutation, Product specificity, Erwinia rhapontici蔗糖异构酶(sucrose isomerase, SI, EC 1)是分子内异构酶，可以通过分子内转糖苷作用转化基金项目：本研究由国家科技支撑项目(2007BAD75D06 )和广西科技攻关项目(桂科攻 0895003-4-1 )共同资助蔗糖(sucrose, 2-O-D-glucopyranosyl-D-fructofuran-ase)形成异麦芽酮糖(isomaltulose, 6-O-D-glucopy- ranosyl-D-fructofuranase)和海藻酮糖(trehalulose, 1-O-D-glucopyranosyl-D-fructofuranase) (图 1)，并伴 随产生少量的蔗糖水解产物葡萄糖和果糖。酮糖合成酶(trehalulose synthase)。如何从 SI 序列和蛋白结构上的差异解释不同微生物来源的 SI 产物 中异麦芽酮糖和海藻酮糖比例的变化? Zhang 等 (2003b) 通过对源自克雷伯氏菌 LX3 的异麦芽酮糖 合成酶 PaI 的蛋白质二级结构分析和氨基酸序列比 对，发现 PaI 的氨基酸序列中有一个决定产物特异 性(product specificity)的 325RLDRD329 基序(motif)。对 该基序中 4 个带电荷氨基酸残基进行定点突变，结果显示突变其中任一个带电氨基酸残基可使转化产物中海藻酮糖的含量提高 17%61%，异麦芽酮糖 降低 26%67%。因此推定该基序控制着 SI 的产物 特异性。大黄欧文氏菌 SI 的氨基酸序列上同样具有相 应的 325RLDRD329 基序序列。本研究以大黄欧文氏菌NCPPB 1578 (E. rhapontic NCPPB 1578) 的 SI 为材 料，对该酶的控制产物特异性基序氨基酸残基进行点突变，探讨该基序对大黄欧文氏菌 SI 酶学性质的 影响，为 SI 的作用机理研究和分子改造提供依据。图 1 SI 催化反应蔗糖异构反应式Figure 1 Scheme of isomerization of sucrose by SI异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体。与蔗糖不同，异麦芽酮糖的果糖基半缩醛羟基暴露，因此，它是一 种具有还原性的二糖。异麦芽酮糖的还原能力为葡 萄糖的 60%，甜度为蔗糖的 42% (Cheetham, 1984)。 该糖风味与蔗糖相似，但口腔致龋齿微生物不能代 谢，所以它可以作为不致龋齿的甜味剂替代蔗糖。异 麦芽酮糖经加氢后得到异麦芽糖醇(isomaltitol)，该 糖醇能被人体肠道中的有益微生物代谢，是一种双 歧因子(Minami et al., 1990; Ooshima et al., 1991)，已 被广泛地用于保健产品和食品工业。现有的异麦芽 酮糖生产工艺均采用固定化细胞转化蔗糖工艺，转 化过程中实际起作用的成分为菌体产生的 SI。目前 已有红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum) (Matteset al., 1999)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica) (Fu- jii et al., 1983)和大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)固定化细胞应用于商业化生产异麦芽酮糖，其中大黄欧文氏菌的细胞固定化柱半衰期可长达 8 500 h(Cheetham et al., 1982)。不同微生物来源的 SI 转化蔗糖的产物，具有不 同的异麦芽酮糖和海藻酮糖的比例。红色精朊杆菌、普城沙雷氏菌、大黄欧文氏菌、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、克雷伯氏菌 LX3 (Klebsiella sp. LX3)和分散泛菌 UQ68J (Pantoea dispersa UQ68J)转 化蔗糖产物主要是异麦芽酮糖(75%91% ) (Fujii etal., 1983; Mcallister et al., 1990; Huang et al., 1998; Mattes et al., 1998; Zhang et al., 2002; Wu and Birch,2005)，所产生的 SI 也称为异麦芽酮糖合成酶(isomaltulose synthase)。而嗜温嗜酸假单胞菌 MX-45 (Pse- udomonas mesoacidophila MX-45)和放射形土壤杆菌 MX-232 (Agrobacterium radiobacter MX-232)转化蔗 糖产物为海藻酮糖(88%90%) (Miyata et al., 1992; Nagai-Miyata et al., 1993)，所产生的 SI 则称为海藻1 结果与分析1.1 不同来源的 SI 氨基酸序列比对将大黄欧文氏菌 NCPPB 1578 的 SI 基因序列 (GenBank 登录号为 AY223550)所编码的氨基酸序 列用 Blastx 软件检索 GenBank 氨基酸数据库，结果 表明与来自大黄欧文氏菌 DSM 4484 的 SI 基因编码 的氨基酸序列 100%同源。而与克隆自大黄欧文氏菌 WAC2928 的 SI 基因编码的氨基酸序列的同源性为98%。该基因所编码的氨基酸序列与来自于其它微 生物的 SI 氨基酸序列有着较高的同源性。如：与来 源于克雷伯氏菌 LX3 的 SI 氨基酸序列比较，等同的71%，相似 83%；与来源于分散泛菌的 SI 氨基酸序列 比较，等同的 71%，相似 81%；与来源于嗜温嗜酸假 单胞菌的海藻酮糖合成酶氨基酸序列比较，等同的67%，相似 78%。同时，该序列还与寡聚 -1,6- 葡萄糖 苷酶(oligo-1,6-glucosidase)有着较高的同源性，如：与来源于气味沙雷氏菌 4Rx13 (Serratia odorifera 4Rx13)的寡聚 -1,6- 葡萄糖苷酶氨基酸序列比较，等同的81%，相似 89%。应用 NCBI 的 COBALT multiple alignment tool对不同来源的 SI 氨基酸序列进行多序列比对。图 2 可以更明了地显示不同来源的 SI 氨基酸序列具有很 高的同源性，而同源性较低的最大区域分布在 N 端 的信号肽序列区域及 C 端。基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology558图 2 SI 氨基酸序列的比对注: E. rha: E. rhapontic (GenBank 登录号: AY223550); K. sp: Klebsiella sp. LX3 (GenBank 登录号: AY040843); P. mes: P. mesoaci- dophila MX-45 (GenBank 登录号: DQ304536); P. rub: P. rubrum (GenBank 登录号: CQ765963); P. dis: P. dispersa UQ68J (Gen- Bank 登录号: AY223549);“325RLDRD329”基序用下划线显示Figure 2 Amino acid sequence alignment of SIsNote: E. rha: E. rhapontic (GenBank accession number: AY223550); K. sp: Klebsiella sp. LX3 (GenBank accession number: AY040843); P. mes: P. mesoacidophila MX-45 (GenBank accession number: DQ304536); P. rub: P. rubrum (GenBank accession number: CQ765963); P. dis: P. dispersa UQ68J (GenBank accession number: AY223549); The“325RLDRD329”motif is underlined低温诱导，采用 Ni 金属螯合柱纯化分离，提纯得到各突变体蛋白。用 10%变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS- PAGE)进行电泳检测，SDS-PAGE 图谱显示(图3)，提纯的重组野生型 SI 蛋白与其它 5 个突变体蛋白样品1.2 突变体的构建和表达在我们前面的研究中，通过 PCR 从大黄欧文氏 菌 NCPPB 1578 中克隆得到了不包括信号肽序列的1091 803 bp 的大黄欧文氏菌的 SI 基因，并以pQE30为表达载体，实现了 SI 基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的可溶性高效表达(周兴等, 2011)。本研究以重组表达质粒 pQE30-SI 为模板，通过 PCR 定点突变方法，分别构建 R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 个 突变体。所有突变体均进行 DNA 测序验证，测序结果与设计相一致。突变体表达质粒用热激法转化到表达宿主 E. coli M15 中，经 10 mol/L 超低浓度IPTG (iso propyl- -D-thiogalactopyranoside) 和 28均在约 60 kD 处出现浓度较一致的单一蛋白条带，表明突变没有导致突变体蛋白分子量大小以及其表达水平发生明显的变化。1.3 突变对产物组成和酶学特性的影响对所构建的突变体蛋白进行相关酶学性质的测 定，结果显示( 表 1)：在第 325 位氨基酸残基位点 (Arg325)和第 328 位氨基酸残基位点(Arg328)，以带负电 荷侧链的天冬氨酸残基(Asp, D)替代带正电荷侧链表 1 突变体转化蔗糖的活力及产物组成Table 1 Product composition of sucrose conversion by the mutants and the mutants enzyme kinetics酶Enzyme异麦芽酮糖含量(%)Isomaltulose content (%)海藻酮糖含量(%)Trehalulose content (%)其它 a (%)Others a (%)比活力(U/mg)Specific activity(U/mg)相对活力(%)Relative activity (%)Glu+Fru(%)Iso/TreratioKm(mmol/L)野生型Wild-type R325D R328A R328D R328Q D329NND b83.8346.866.710013.765.259.666.982.814.219.323.319.912.267.715.514.313.25.04.4ND2.8ND ND0.963.382.563.366.7988.7107.689.1220.3116.87.916.910.411.67.911.825.315.517.411.8注: Glu+Fru: 葡萄糖+果糖; Iso/Tre: 异麦芽酮糖 / 海藻酮糖; a 其它: 未知寡糖; b ND: 未检测到Note: Glu+Fru: Glucose+fructose; Iso/Tre: Isomaltulose/trehalulose; a Others: Undetermined oligosaccharides; b ND: Not detected图 3 SI 及其突变体的 SDS-PAGE 检测注: M: 蛋白质 Marker; 泳道 16: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q和 D329NFigure 3 SDS-PAGE of SI and its mutantsNote: M: Protein Marker; Lane 16: SI, R325D, R328A, R328D, R328Qand D329N的精氨酸残基(Arg, R)，所构建突变体 R325D 和 R328D的 Km 值接近野生型 SI 的 2 倍；在 Arg328 位点突变 为带非极性侧链的丙氨酸残基(Ala, A)，其 Km 值升 至野生型 SI 的 2.3 倍，而同一位点突变为不带电荷 极性侧链的谷氨酰胺残基(Gln, Q)，其 Km 值上升至 接近野生型 SI 的 5 倍；Asp329 氨基酸残基突变为天 冬酰胺残基(Asn, N)，是相对保守的突变，突变体 D329N 的 Km 值达到野生型 SI 2.5 倍。对突变体的比活 力测定显示，所构建的 5 个突变体的比活力均剧烈下 降，其相对比活力达到野生型的 11.8%25.3%。以蔗糖为底物，加入突变体蛋白进行反应。采用 高效液相色谱(HPLC)分析对反应产物中的糖组份进 行检测。HPLC 分析图谱显示(图 4)，SI 及其突变体转 化蔗糖的产物中，除底物蔗糖外，均出现与异麦芽酮糖、葡萄糖和果糖标样滞留时间相同的峰；突变体R325D 和 R328D 产物中还出现了一个滞留时间比蔗图 4 SI 及其突变体转化产物的 HPLC 检测注: 图 AF: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q, D329N; 1: 果糖; 2: 葡萄 糖; 3: 蔗糖; 4: 异麦芽酮糖; 5 海藻酮糖; 6: 未知寡糖Figure 4 HPLC analysis of the composition of products converted by SI and its mutantsNote: AF: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q, D329N; 1: Fructose; 2: Glucose; 3: Sucrose; 4: Isomaltulose; 5: Trehalulose; 6: Undeter-mined oligosaccharide基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology560糖、异麦芽酮糖及海藻酮糖这些二糖滞留时间更长的产物，该化合物初步断定为未知结构的寡糖。通过 比较这些组份的峰面积，结果显示( 表 1)：Arg325 和 Arg328 分别突变为带相反电荷侧链的 Asp，导致产物 中异麦芽酮糖 / 海藻酮糖的比例变化最大，从野生型 蛋白的 6.93 分别降至 0.96 和 2.92，并且 突 变 体 R325D 反应产物中海藻酮糖含量超过了异麦芽酮糖 含量。突变体 R328A 和 R328Q 的反应产物中异麦芽酮 糖与海藻酮糖比例下降幅度较一致，分别为 3.38 和3.36；但 Asp329 突变为 Asn 没有导致反应产物中异麦 芽酮糖与海藻酮糖比例发生改变。表 1 结果还显示： 在 R325D、R328A、R328D 和 R328Q 突变体反应产物中，异 麦芽酮糖与海藻酮糖比例下降的同时，水解产物葡萄糖和果糖的比例上升，R325D 达到最高(66.7%)，说 明这些突变导致了 SI 的分子内转糖苷活性下降而 水解活性上升。(325RLDRD329)基序为研究对象，构建了 R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 个突变体。所测定 5 个突变体的 Km 值上升、其比活力下降，结果与 Zhang 等(2003b)对克雷伯氏菌 LX3 的 PalI 研究结果相类似。表明控制产物特异性基序中 R325、R328 和 D329 3 个带电氨基酸残基对 SI 的酶活具有重要作用。本研究对 各突变体转化蔗糖产物中糖组分的分析结果则表明，除 D329N 突变体外，其它 4 个突变转化蔗糖产物中，异麦芽酮糖的比例下降，而海藻酮糖比例上升。说明这些位点的突变对 SI 的产物特异性产生影响。但 本 研究测定出的糖组分变化幅度与 Zhang 等(2003b)的结果存在较大差异。Zhang 等构建的 D329N突变体产物中异麦芽酮糖的含量从 82.8% 降 至30.4%，而海藻酮糖的含量则从 12.1%上升至 66.8%。本研究构建的 D329N 突变体的转化蔗糖产物的各糖组分的比例与野生型蛋白相比基本没有变化(两者含 量分别为 82.8%和 12.2%)。Zhang 等构建的 R325D 突 变体产物中异麦芽酮糖和海藻酮糖含量分别为 15.8% 和 55.7% ，本研究的 R325D 突变体分别只有13.7%和 14.2%，并且蔗糖水解产物葡萄糖和果2 讨论序列比对和结构分析表明 SI 属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase) 家族 13 的新成员(Zhang et al.,2003a)。不同来源的 SI 转化蔗糖的产物中，异麦芽酮 糖与海藻酮糖含量的比例迥异。如来源于分散泛菌UQ68J 的 SI 的蔗糖反应产物中，异麦芽酮糖含量达 到 91%，海藻酮糖只有 3% (Wu and Birch, 2005)；而嗜温嗜酸假单胞菌 MX-45 的 SI 的蔗糖反应产物中，两者比例恰恰相反，异麦芽酮糖含量只有 8%，海 藻酮糖却高达 91% (Miyata et al., 1992)。同时值得注意的是：同属于 SI 的异麦芽酮糖合成酶和海藻酮糖合成酶的氨基酸序列具有很高的同源性(图 2)。如何 从这些酶的氨基酸序列和结构的细小差异上解释这一现象？Zhang 等(2003b)基于序列比对和突变实验结果，提出以异麦芽酮糖为主要产物的 SI 均具有保 守的 325RLDRD329 基序，该基序控制了产物特异性；而以海藻酮糖为主要产物的嗜温嗜酸假单胞菌 MX-45 的 SI 相应的序列不同，其序列为 311RYDRA315。A- roonnual 等(2007)通过点突变方法，突变了肺炎克雷伯氏菌 NK 33-98-8 (Klebsiella pneumoniae NK 33-98-8)的 SI (异麦芽酮糖为主产物)的产物特异性基 序，他们的结果表明，突变体 L326Y 和 D329A 并没有导致产物中异麦芽酮糖含量的下降及海藻酮糖含量的上升，只是酶比活分别下降了 2 倍和 6 倍；而将该基 序整个突变为嗜温嗜酸假单胞菌 MX-45 的 SI (海藻 酮糖为主产物)的 311RYDRA315 序列，不但产物的比例 没有变化，其酶比活力还下降了 24 倍之多。本研究以大黄欧文氏菌 SI 的控制产物特异性糖的含量高达 66.7%，表现出极强的蔗糖水解活性。本研究的 R328D 突变体产物中异麦芽酮糖和海藻酮糖含量分别为 59.6%和 23.3%，而 Zhang 等构建的 R328D 突变体转化蔗糖结果为 19.2%和 73.3%。以上 结果对比表明大黄欧文氏菌 SI 的控制产物特异性基序对产物特异性的影响并没有像克雷伯氏菌 LX3 的 PalI 那样显著，可能该基序并不是影响大黄欧文氏菌 SI 产物特异性的单一因素。对大黄欧文氏菌 SI 的控 制产物特异性研究，或许还需要寻找到其它位点。3 材料与方法3.1 供试材料所用菌株和质粒的特征及来源见表 2。所有大肠 杆菌克隆均用 Luria-Bertani (LB)培养，并根据实验需 要加入所需浓度的抗生素：构建突变体时，LB 培养基加入氨苄青霉素至终浓度 50 mg/L；重组蛋白表达时，LB 培养基加入氨苄青霉素至终浓度 100 mg/L。异麦芽酮糖、蔗糖、葡萄糖和果糖标准糖分子样 品购自 Sigma 公司(海藻酮糖无标样)。3.2 突变体构建定点突变的模板为重组质粒 pQE30-SI。PCR 反 应体系 50 L，扩增酶为大连宝生物公司的 PrimeS- TARTM HS DNA Polymerase，突变体引物见表 3。扩增表 2 供试菌株与质粒Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this study菌株与质粒Strain or plasmid特征Characterization来源Source大肠杆菌 XL10-GoldE. coli XL10-Gold大肠杆菌 M15E. coli M15 pQE30克隆宿主Cloning host 表达宿主 Expression host 大肠杆菌表达载体E. coli expression vector质粒 pQE30 中克隆有 SI 基因 1091 803 bp 序列片段pQE30 containing coding region of SI from nucleotides 109 to 1 803质粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 325 位精氨酸残基突变为天冬氨酸残基Arg residue at 325 in SI replaced by Asp in pQE30-SI质粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸残基突变为丙氨酸残基Arg residue at 328 in SI replaced by Ala in pQE30-SI质粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸残基突变为天冬氨酸残基Arg residue at 328 in SI replaced by Asp in pQE30-SI质粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸残基突变为谷氨酰胺残基Arg residue at 328 in SI replaced by Gln in pQE30-SI质粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 329 位天冬氨酸残基突变为天冬酰胺残基Asp residue at 329 in SI replaced by Asn in pQE30-SIStratageneQiagenQiagenpQE30-SI实验室保藏Laboratory collection本研究 This work 本研究 This work 本研究 This work 本研究 This work 本研究 This workpQE-R325DpQE-R328ApQE-R328DpQE-R328QpQE-D329N表 3 突变体引物序列 aTable 3 Primers sequences used in site-directed mutagenesis aSDS-PAGE 检测，有正常的目的表达带的菌株为候选菌株。划线分离后，由上海生工公司进行测序验证。3.3 重组蛋白的表达和纯化所有突变体均以 E. coli M15 为表达宿主。挑 取一个单菌落接种到含 100 mg/L 氨苄青霉素的50 mL LB 培养基，37振荡培养至 OD600 0.6 左右；按1%接种量接种至 500 mL 的含 100 mol/L 氨苄青霉 素的 LB 培养基，继续在 37振荡培养至 OD600 0.6，加入 IPTG 至终浓度 10 mol/L，28诱导过夜。离心收 集诱导的菌体，冰浴超声破碎上样缓冲液(20 mmol/L咪唑, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L, pH 6.0 磷酸盐)重新 悬浮菌体。破碎后的菌体上清液过 Ni 金属螯合柱，以80 mmol/L 咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L (pH 6.0)磷酸盐缓冲液洗杂蛋白，最后收集 200 mmol/L 咪唑洗 脱的蛋白峰。纯化蛋白用 10% SDS-PAGE 分析。蛋白浓 度用 Bradford 法测定，牛血清白蛋白为蛋白浓度标准。3.4 蔗糖的体外转化200 L 反应液体系由 400 mmol/L 蔗糖加 1020 g 蛋白组成，蔗糖和蛋白均用 50 mmol/L 磷酸盐(pH 6.0)溶解。加入蛋白混匀后立即放入 30水浴锅突变体Mutant引物序列(5-3)Primer sequence (5-3)R325DR328A R328D R328QD329NGTTTGATCTGATCGATCTCGATCGTGATGGATCAGGCTCGATGCTGATGCTGATG GATCAGGCTCGATGATGATGCTGATG GATCAGGCTCGATCAAGATGCTGATG GCTCGATCGTAATGCTGATGAAAG注: a 只显示正向引物序列; 反向引物与正向引物序列完全配对; 下划线显为突变位点Note: a Only the sequences of forward primers are shown; The se- quences of reverse primers for each mutant are complementary to those of its forward primers; The nucleotides underlined indicat-ed the sites of mutation条件：95 1 min，98 15 s，5054 30 s，72 6 min，25 个循环后，72 继续延伸 10 min。 PCR 产物用 Dpn 消化过夜，去除模板 DNA 后，取 5 L 用热激 法转化到 E. coli XL10-Gold 后，涂布在加有氨苄青霉 素(50 mg/L)的 LA 平板上。37培养 12 h 以上，从平 板中挑取单菌落接种到 5 mL LB 培养液中，37培养 至菌液略显浑浊，取 0.2 mL 菌液，加入 IPTG 至终浓 度 0.5 mmol/L，28诱导表达 4 h，离心收集菌体，用反应，水浴 1030 h 后置于沸水浴中 5 min 终止反应。反应产物用 HPLC 检测。基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology5623.5 糖的分析还原糖的定量分析采用水杨酸(DNS) 法。 取95 L 蔗糖(终浓度 200 mmol/L)，加入 25 L 酶液，迅 速混匀后于 30水浴中保温 30 min，取出并立即加入180 L DNS 溶液终止反应，沸水浴 5 min。以葡萄糖 为还原糖标样制作标准曲线，用酶标仪测定 540 nm波长处的吸光值，根据标准曲线计算出反应产物中 还原糖的量，并计算酶活力。酶活力单位定义为：在上述分析条件下，每分钟催化形成相当于 1 mol 葡 萄糖的还原糖所需的酶量为 1 个活力单位。糖组份的分析采用 HPLC 法。仪器为 Waters600，检测器为 Waters 2414 示差检测器，分析柱为 Wa- ters 的高效碳水化合物分析柱(4.6 mm250 mm, 4 m)， 流动相为乙腈:水，80:20 (v/v)，以 1 mL/min 恒定流量 洗脱。积分得到各组分的峰面积，并由此计算出各组分的相对百分比(relative percentage)。3.6 SI 及其突变体的 Km 测定反应温度为 30，缓冲液为 50 mmol/L 磷酸盐 (pH 6.0)缓冲液。以 560 mmol/L 不同浓度的蔗糖为 底物，DNS 法测定单位时间内反应产生的还原糖量， 计算出反应的初速度。重复测定 3 次，取平均值为最 后结果。最后根据 Lineweaver-Burk 作图法计算得出 重组 SI 及其突变体的 Km 值。isoma ltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici,Biochem. J., 220(1): 213-220Cheetham P.S.J., Imber C.E., and Isherwood J., 1982, The forma- ton of isomaltulose by immobilized Erwinia rhapontici, Na- ture, 299(5884): 628-631Fujii S., Kishihara S., Komoto M., and Shimizu J., 1983, Isolation and characterization of oligosaccharides produced from su- crose by transglucosylation action of Serrtia plymuthica, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 30: 339-344Huang J.H., Hsu L.H., and Su Y.C., 1998, Conversion of sucrose to isomaltulose by Klebsiella planticola CCRC 19112, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 21(1-2): 22-27Mattes R., Klein K., Schiweck H., Kunz M., and Munir M., 1998, DNAs encoding sucrose isomerase and palatinase, United States Patent 5786140Mattes R., Klein K., and Stegmier S., 1999, Sucrose metabolism, United States Patent 5985668Mcallister M., Kelly C.T., Doyle E., and Fogaty W.M., 1990, The isomaltulose sythesising enzyme of Serratia plymuthica, Bio- technol. 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