应用于湿热灭菌的生物指示剂现状与分析.docx

应用于湿热灭菌的生物指示剂现状与分析璜1 ，马仕洪1 ，崔强2 ，胡昌勤1*肖( 1 中国食品药品检定研究院，北京 100050; 2 华瑞制药有限公司，江苏 无锡214092)摘 要 从研究历史、应用现状、类型划分、菌株使用和考察因素 5 方面对应用于湿热灭菌的生物指示剂进行了分析。发现目前市售生物指示剂生产使用环节中缺乏关键因素 D 值的测定，建议由第三方提供技术支持衔接完善。同时，对生物指示剂深入的探索和开发，才能够实现其在灭菌工艺验证整体环节中的应用。关键词 生物指示剂; D 值; 技术支持中图分类号 Q939 97文献标识码 A文章编号 1005 7021( 2014) 04 0077 03doi: 10 3969 / j issn 1005 7021 2014 04 015Current Situation Analysis of Bio-Indicators Appliedin Moist Heat SterilizationXIAO Huang1 ，MA Shi-hong1 ，CUI Qiang2 ，HU Chang-qin1( 1 Natl Inst for Food Drug Ctrl ，Beijing 100050; 2 Sino-Swed Pharm Co Ltd ，Wuxi，Jiangsu 214092)AbstractBased on the literature review and investigation and study of early days，the application of bio-indicatorsin moist heat sterilization of was analyzed in five aspects: history of study，application status，differentiation of type，use of strains，and investigation factors It was found that current available commercially bio-indicators are lack of key factor-D value measurement in production and utilization，so it is recommended that technical support could be provid- ed by a third party to for complete linkage Meanwhile，the deepening of exploration and development could be real- ized the application of bio-indicators in the whole link of sterilization technology verificationKeywords bio-indicators; D value; technical support世界各地每年都有因灭菌不彻底造成的感染事件的报道。因此，国内外对于灭菌监测都给予 了高度重视并制定相应的法规进行支持保障1。 灭菌监测主要有 3 种形式: 物理监测、化学监测和生物监测。物理监测通过对时间、温度、压力等物 理参数进行测量，能够确认灭菌工艺运行状态是否符合设定要求，可估测灭菌工艺对微生物的致 死性2。化学监测是使用某些热敏化学物质配成 印墨后印制成指示剂，通过其颜色改变反映所经 历的温湿度及压力变化3，从而反映被灭菌器物 是否经历设定的灭菌过程。生物监测是通过标准化的菌株和合乎要求的抗性来考察微生物的杀灭情况，直接体现了整个灭菌过程是否达到需求，被认为是灭菌效果成功与否的最终判定4。本文对 生物监测所使用的生物指示剂进行分析综述。1生物指示剂的研究历史19 世纪末，一名英国医生报告了使用鸡蛋作为生物指示剂进行灭菌效果判定的案例，主要是通过鸡蛋的凝固来判定灭菌效果，虽然这种方法 较为粗糙且可靠性存在问题，但首次从概念上引 入了生物指示剂，使人们开始意识到需要开展灭 菌监测活动。因为嗜热脂肪芽胞杆菌所产芽胞无致病性、无热原、无毒，且对压力蒸汽的抗性强于基金项目: 中国食品药品检定研究院学科带头人培养基金( 2011X2)作者简介: 肖璜 女，硕士，助理研究员。研究方向为药物分析、药品微生物检验。E-mail: anyway00000 126 com*通讯作者。男，研究员，博士生导师。主要从事药物质量分析与质量评价的研究。Tel:E-mail: hucq nifdc org cn收稿日期: 2014-06-29; 修回日期: 2014-07-18微 生 物学 杂 志34 卷78大多数微生 物5，美国国立卫生研究院 ( NationalInstitutes of Health，NIH) 于 1955 年开始使用它来 制备生物 指 示 剂。 生物指示剂的商品化则是从 1957 年一家 美 国 公 司 在芝加哥的全美医院协会 上推荐使用开始。力灭菌生物指示剂的标准菌株收录且被大规模商品化使用。其他耐热芽胞菌，如生孢梭菌等也被 报道用于湿热灭菌工艺的验证6。芽胞形成阶段 所产生的名为吡啶二羧酸的特殊物质与 DNA 以 及细胞内的酶形成复合物，使得处于恶劣环境的 芽胞休眠存活11。因此，推荐菌株多采用芽胞类细菌。近年出现了其他暴露条件( VHP) 下非芽胞类细菌抗性更高的相关报道12，但在湿热灭菌条 件下，芽胞类细菌作为生物指示剂仍是标准化的 选择。2生物指示剂的应用现状卫生医疗领域对染菌物品采用过度杀灭的灭菌方法，而某些热稳定性较低产品则需按产品特性经过完备的灭菌工艺开发和确认环节后才能确 定其灭菌工艺。由于能够直观反应微生物在经历 灭菌过程后的存活程度，生物指示剂的应用并不 局限于灭菌监测，还能够应用在程序开发中的关 键参数 设 定、系 统 适 应 性 实 验、变 更 控 制 等 环 节6-7。目前国内已经开始探索应用生物指示剂 验证灭菌工艺。5考察因素生物指示剂有 2 项主要性能: 孢子数量和以D 值表征的对灭菌工艺的抗性。5 1孢子数量灭菌是指杀灭微生物的过程。微生物存活概率( 也称无菌保证水平，Sterility Assurance Level，SAL) 常常被用来评价医疗产品的灭菌程度。各 国药典均对灭菌制剂进行了量 化 描 述: SAL 10 6 ，即经灭菌后产品中污染微生物存 活 概 率 不大于百万分之一。目前商品化湿热灭菌用生物指 示剂的孢子数量基本控制在 106 的数量级。2010 年版中国药典中规定“对灭菌手段耐受性差的产 品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺 中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌 种和孢子数量”。由于孢子数量是衡量灭菌工艺 生物杀灭力的重要参数，故需事先确定其适用性， 方可应用于产品灭菌工艺的开发和验证。孢子数量同时是基于商品化产品稳定性考察 所需要严格控制的内容，USP 要求生物指示剂生 产厂家应能提供效期内的微生物总数数值; 生物 指示剂使用者在应用前能够对每使用单位的平均菌落数进行测定8。然而国内市场上某些商品化 产品在效期内的微生物总数不能达到其标称。3生物指示剂的类型划分美国 药 典 ( TheUnited States Pharmacopeia，USP) 将生物指示剂分为 3 类: 由微生物孢子和载体( 可能是碟状或条状的滤纸、玻璃、塑料以及 其他材料的) 包装而成的第一类生物指示剂; 由可接种在产品表面或内部的孢子悬液构成的第二类生物指示剂; 将微生物恢复的生长培养基包 含其中的第三类生物指示剂，也称为自含式生物指示剂8。市场上有标准推荐的相关菌株销售，开展工 作时基于经济因素考虑，有部分用户自行制备第 一类或第二类生物指示剂，但操作的不便利性( 需要无菌以及转种等技术) 使得更多的用户选择使用第三类生物指示剂。相比于前 2 种指示剂，第 三类生物指示剂具有不需自配培养液、取材简单不易造成二次污染、培养结果明显、生物检测合格率高的优点9，但需要观测 24 48 h 才能得到最 终结果。为了提高使用快捷性，市场上出现了快速生物指示剂。基于芽胞生长初始阶段某类酶的 激活 可 促使非荧光基质转化为荧光物质的原 理10，快速生物指示剂能够将检测时长缩短至几 个小时，也有人将其作为第四类生物指示剂。D 值5 25 2 1 D 值的影响因素 D 值是生物指示剂需要考察的关键因素。D 值定义为在规定的暴露条 件下，灭 活 90% 的试验菌所需的时间或辐射剂 量13，它是微生物对于暴露损伤抵抗力强弱最直 接的表征。D 值的影响因素较多，在 制 备 形 成 阶 段，各种营养成分往往对微生物自身的 D 值产生 影响14-15; 在应用 过 程 中，生 物 指 示 剂 D 值 受 到4菌株使用目前，嗜热脂肪芽胞杆菌被各国药典作为热4 期肖璜等: 应用于湿热灭菌的生物指示剂现状与分析79外部因素影响，例如第一类生物指示剂中菌片的外包装材料16、第二类生物指示剂中孢子悬液所 加入的各种 介 质17 和第三类生物指示剂整体包 装材质。国际标准J 中国护理管理，2008，8( 2) : 67-72黄靖雄，何珉，王之栋 压力蒸汽灭菌监测进展J 中国护 理管理，2012，12( 7) : 12-14董薪，宋烽，于秀荣 压力蒸汽灭菌器质量认证的监测 方 法J 中华医院感染学杂志，2009，19( 15) : 1988-1989贾秀亭 浅谈压力蒸汽灭菌器效果监测J 中国实用医药，2012，7( 23) : 268-270吴潇，刘波，姚粟，等 嗜热脂肪芽孢杆菌的特性及应用J 中国消毒学杂志，2011，28( 2) : 215-217 熊海元，潘友友，崔强，等 生孢梭菌孢子作为生物指示剂用 于残存概率灭菌工艺验证的可行性J 中国药事，2003，17( 9) : 577-579高海燕，陈军丽，丁恩峰，等 浅析 USP 对生物指示剂的技术 要求J 医药工程设计，2010，31( 3) : 20-23The United States Pharmacopeial Convention USP36-NF31，1M United States: United Book press，2012: 536-539235 2 2D 值的测定D 值的测定可采用 2 种方4法，一是直 接 计 数 法，二 是 部 分 阴 性 法13。前 者需使用不同的暴露时间下存活芽胞数的对数值做 回归方程; 后者需统计不同暴露时间的存活或死 亡样本数，选择不同统计公式计算。无论采用哪 种方法，都需要进行平行样本的测定。但传统的 灭菌器由于腔体内存在冷点和升降温过程每个循 环不同，样本的平行性难以保证。因此，D 值测定需使用专门的仪器抗力仪或油浴装 置18。 不同于普通的灭菌器，抗力仪是被设计用于建立 精确的、可复现的灭菌环境的测试设备。由于其 对于准确测量、精确控制及快速变化速率的要求， 已经接近商用过程控制 和校准仪器准确度的极 限19。目前，国内已能够自主研发和生产应用于 湿热灭菌的抗力仪。USP 要求生物指示剂生产厂家应能提供包括 D 值、D 值测定方法等相关信息; 生物指示剂使用 者在应用前能够对生物指示剂 D 值进行评估8。然而，国内生产厂家所提供的 D 值仅为使用菌株 的参考 D 值而非测量值，而使用方也往往不能对 D 值进行评估。出现了使用中基于化学监测发现 灭菌程序异常而生物监测并未发现问题的相关报 道20，从侧面佐证了目前某些商品化生物指示剂 产品的质量存在着问题。56789 安玉梅，周存英，刘相娟 两种生物指示剂对压力蒸汽灭菌器生物监测的影响J 当代护士( 专科版) ，2010( 10) : 154-15510 何曙云，邵珍红，刘宇英，等 生物指示剂的实验评价J 中 华医院感染学杂志，2000，10( 3) : 202-20311 魏莉，解丽英 关于湿热灭菌工艺的微生物验证讨论J 华 章，2011，( 1) : 23212 Pottage T，Macken S，Walker J T，et al Meticillin-resistantStaphylococcusaureus is more resistant to vaporized Hydrogen peroxide than commercial Geobacillus stearothermophilus biolog- ical indicatorsJ Journal of Hospital Infection，2012，( 80 ) :41-4513 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 GB / T 19972-2005 / ISO 14161: 2000 医疗保健产品灭菌生物指示剂选择 /使用及检验结果判断指南S14 周涛 浅 谈 脉 动 真 空 灭 菌 器J 装备应用与研