第4节胚胎培养(笔记)

第三章 植物主要组织培养方法,第一节 植物离体无性繁殖第二节 无病毒植物培养第三节 植物花药和花粉培养第四节 植物胚胎培养,第四节 植物胚胎培养,一、 植物胚胎培养的概念及应用二、 植物胚胎培养的内容,一、 植物胚胎培养的概念及应用 （一）概念：指将植物胚或具胚器官（如子房、胚珠）等在离体条件下进行无菌培养，并使之发育成植株的技术。,种皮,胚,子叶两片,子叶一片,子叶储存营养物质,胚乳储存营养物质,无胚乳,有胚乳,（二）植物胚胎培养的应用,1.克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 植物界在长期的自然选择条件下产生了两种受精隔离机制，即异花授粉植物拒绝自花受精，和异花授粉植物拒绝异种受精。,在高等植物种间和属间远缘杂交中，拒绝异种受精往往会受到以下育性障碍：,育性障碍,花粉在异种植物柱头上不萌发。（试管受精）花粉管生长正常但胚往往由于胚乳败育等原因而败育（杂种不活）（幼胚培养）。合子由于缺乏同源染色体无法配对而败育。 由于以上原因，远源杂交中难以得到种子。（杂种不育）（幼胚培养）,受精障碍，通常发生在柱头或花柱中，即由于花粉与柱头识别反应导致花粉管生长受到抑制，不能进入柱头或在花柱中生长停滞以致受精失败。因此有可能利用离体的胚珠授粉顺利完成受精。这方面已在矮牵牛属植物试验成功。,2.打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限,种子休眠的概念：活种子在适宜的萌发条件（温度、水分和氧气等）下仍不能发芽的现象。,种子休眠的作用： 在自然条件下，种子休眠的特性是植物适应环境的一种表现。生长在温带的植物，如果它们的种子在秋天成熟以后，落入土壤很快就又发芽，冬天到来，幼苗就会被冻死，这种植物便有绝种的危险。相反，种子具有休眠的特性，就可以避过严冬，保住后代。所以，种子暂时的休眠正好保证了日后能够顺利萌发，这种特性对于植物种类延续繁衍后代具有重要意义。,具有休眠性的种子，休眠时间长短不同，短的只有几周，长的有二三年。造成种子休眠的原因，一般有以下3种情况：,第一种，像莲、刺槐、皂角等的成熟种子，外面的种皮坚硬致密，空气和水分很难透进去。这样的种子，即使播种在潮湿温暖的土壤里，很长时间也不会萌发。要想萌发，必须磨破它的种皮。,第二种，从表面上看，种子已经成熟，而且也脱离了母体植株，但是种子里起主要作用的胚并没有完全发育，还需要再过一段时间才能成熟。银杏、红松、天麻、兰花等种子的休眠属于这种原因。,第三种，把西红柿、黄瓜（里面含有种子）种入地下、或取出它们的种子直接种下，都要经过很长时间才能萌发甚至根本不萌发。这是由于西红柿、黄瓜等的果实里含有抑制种子萌发生长的物质（如某些植物碱、有机酸等）。这类种子只有在脱离果实，消除抑制物质的影响之后才能萌发。,打破种子休眠,种子休眠对于植物本身来说,是一种有益的生物学特性,或者说是种子抵抗不良条件的一种适应性,这种适应性是植物在长期进化过程中自然选择的结果。提早萌发，缩短育种年限（实验室）幼胚培养,胚离体培养,提供种胚萌发时所需要的营养物质而萌发剥离后离开了抑制物质的抑制而萌发,3. 使生活力低下或无活力的种子萌发,长期营养繁殖的植物其种子的常无活力，如芭蕉，芋等。胚胎培养时可以克服种子自然的不育性，促使其萌发成苗。,4.使柑橘类植物合子胚正常发育,芸香科柑橘类为多胚植物，种子内存在大量珠心胚（不定胚）。由于珠心胚生活力很强，杂种胚生活力低，因而往往得不到合子胚后代，影响杂交育种效果。利用胚培养技术可以尽早取出合子胚进行培养，从而获得杂种后代。,5. 测定种子生活力,测定休眠后的种子生活力，用常规的种子萌发试验需要很长时间，特别是木本植物一般需要层积处理打破休眠。而1944年Turkey发现未经层积处理的种胚，离体培养条件下不仅可以快速萌发，且萌发速率一致。因此，此法被认为是一种快速而有效的测定种子生活力的方法。,6.获得三倍体植株,因被子植物的胚乳细胞大多为三倍体，胚乳培养可以获得三倍体植株，从而使植物胚胎培养成为一种育种新途径，即用胚乳培养方法代替四倍体和二倍体杂交产生三倍体，用于果树，瓜类产生无籽果实。,其它,快速繁殖特殊植物 通过胚培养可快速繁殖山楂苗木，解决生产上山楂育苗困难的问题。用于理论研究 胚胎培养可研究胚胎发育过程、胚发生的条件以及影响因素、胚乳生长发育及形态建成过程、胚乳与胚之间的相互关系及生理生化机制、受精过程机理等问题。,二、植物胚胎培养的内容,（一）胚培养（二）胚乳培养（三）胚珠（子房）培养（四）试管受精,胚培养,成熟胚培养：自养，培养基要求简单幼胚培养：异养，培养基要求复杂,离体胚形态发生的方式,在进行胚培养时，常见的离体胚生长方式有：正常胚胎发育、胚性发育、早熟萌发和产生愈伤组织。,成熟胚未成熟胚,1. 按正常胚胎发育途径形成植株,2 脱分化形成愈伤组织,离体胚,3 胚“ 早熟萌发”,畸形苗,发育不正常而死亡,离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。,幼胚的培养方法,取材：子房 常规表面消毒 在高倍显微镜下 剥离幼胚，接 种于培养基 送入培养室培养,未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物质。胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂。,幼胚的培养条件,无机氮：渗透压：复杂的天然提取物：活性炭：,包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；,蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，初期高（WHY）。因为自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着。,椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用,吸附有毒物质,有利幼胚培养的因素胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进作用。胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而且保留胚柄减少对胚的直接损失。,胚乳,胚乳在被子植物种子中是普遍存在的。它的主要功能是为发育中的胚提供营养。有的植物，其种子发育初期虽有胚乳，但后期完全被发育中的胚吸收消耗了，因此种子成熟时不具胚乳或者只在种皮下残存12层胚乳细胞，成为无胚乳种子，这种植物的胚则具有肥厚而肉质的子叶，在种子萌发时为胚提供营养。,（二）胚乳培养 1. 概念 ： 将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。,胚乳X3（2极核1精子）是营养组织，影响胚的发育。有些植物在胚发育过程中把胚乳消耗尽（豆科和葫芦科）；有些植物，胚乳在成熟种子中存在，贮存大量营养物质（禾谷类，椰子，咖啡）,2. 胚乳培养的意义,胚乳培养再生植株证明了全能性理论；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；再生植株多为三倍体，产生无籽果实；可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。,由胚乳再生完整植株的物种12科，20多种。蔷薇科：苹果，梨，桃。禾本科：大麦、玉米和水稻。茄科：枸杞，马铃薯。,3. 胚乳培养中的技术关键,胚乳愈伤组织的建立,绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生），极少数直接从胚乳直接分化胚状体。,胚乳发育时期发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织。接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。,胚在胚乳培养中的作用旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的参与，就能形成愈伤组织。完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。胚在萌发时产生某种物质“胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。,4. 胚乳培养过程,胚乳,胚状体发育成苗不定芽苗,柚，柑桔和枣,大麦, 水稻, 玉米, 苹果, 马铃薯,子房壁,果皮,珠被,种皮,胚乳,胚,受精极核,受精卵,种子,果实,（三）胚珠和子房培养,1. 胚珠培养,受精的胚珠培养 未受精的胚珠培养,种子,诱发大孢子形成单倍体,试管受精的受体,2. 子房培养,受精的子房培养 未受精的子房培养,成熟果实，具种子,诱发大孢子形成单倍体,无籽果实,离体受精的受体,总之，胚珠和子房培养的作用,授粉的胚珠和子房培养：促进原胚继续生长，使杂种幼胚发育成熟；,未授粉胚珠和子房，诱导孤雌生殖，产生雌性单倍体。,3、外植体消毒和接种,4、培养基及培养条件,5、离体培养胚胎的发育,胚珠或授粉子房培养，合子胚可以更好地发育成植株。但如果条件不适，也容易从幼胚或珠心组织产生愈伤组织。芸香科易产生珠心胚。培养胚珠，获得大量珠心胚，用以品种复壮、快速繁殖和获得无病毒苗。同时，通过珠心组织培养，产生胚性愈伤组织，建立胚性组织培养实验体系。,（四）试管受精,1. 概念，离体授粉：指在无菌条件下培养未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。因全过程，即从花粉萌发到精卵细胞融合受精形成种子，直至种子萌发产生幼苗，均在试管内完成，故也称之为离体受精、试管受精。 该技术在育种实践上可克服自交不亲和性和远缘杂交障碍，如花粉在柱头上不萌发或花粉管生长缓慢进入花柱受到抑制、或萌发后不能进入胚珠。,离体授粉方法,收集花粉、胚珠（子房）从胎座上切下单个胚珠（裸露胚珠），花粉带着完整胎座或部分胎座，花粉带着完整子房或部分子房，花粉,子房试管授粉,直接引入法注射法,胚珠试管授粉,哺育法接近法,哺育法,将胚珠表面先蘸满有助于花粉发芽的培养基，然后撒上花粉进行培养。 该法是解决胚珠存活率和花粉发芽、花粉管伸长培养基发生矛盾时的做法。,柱头接近法,将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上，然后在柱头周围接种异种植物裸露胚珠，花粉在本种植物的柱头哺育下发芽，花粉管伸长并进入胚珠受精。 该法使解决花粉发芽和胚珠培养在培养基组成上发生矛盾时所采用的方法,影响离体受精的因素,胚珠（子房）的成活率母体组织的影响花粉萌发和花粉管生长速度,鉴别受精的标记性状,有两种现象：胚乳直感、果实直感指杂交授粉后，父本花粉使母本所结杂交种子的胚以外组织直接表现父本性状的现象。或称当代显性。可分为种子直感和果实直感。,种子直感,又称胚乳直感。指杂交种子的胚乳（或子叶）组织直接表现父本同种组织的显性性状的现象。因杂交种子虽然长在母本植株上，但其胚和胚乳却是两个雄核分别与雌配子的卵核和两个极核受精结合的产物，都属于子代（F1）的组织。所以父本的显性胚乳性状必然要在杂交种子上表现出来；而显性的植株性状则必须等杂交种子播种后，由胚所长出的植株从幼苗到成株的发育过程中才能依次表现。由于父本的显性胚乳性状在杂交当代就由母本植株所结的种子上表现，故称种子直感。,玉米的黄胚乳基因（Y）为白胚乳基因（y）的显性，如以白胚乳子粒的玉米自交系（yy）为母本，授以父本黄粒