第二章清洗、消毒级培养基的配制.ppt

第二章 清洗、消毒及培养基的配制,教学目的和要求：2学时,重点和难点：了解实验室器皿消毒的方法；了解培养基的成分及作用,第一节 清洗与消毒,2.2 消毒,2.1 清洗,清洗的目的：为清除杂质和微生物，使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分，其要求比普通实验用器皿的清洗要高。因器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗方法也有区别。,2.1.1 玻璃器皿的清洗,浸泡刷洗浸酸冲洗,要求：干净、透明、无油迹、无残留物,1、浸泡,清水 新的、用过的都要浸泡于水5盐酸,2、刷洗,清洗剂内外,要求：选择软毛刷 不要留死角,3、浸酸,要求：强氧化作用；对玻璃器皿无腐蚀作用; 常用次强酸；不少于6小时。配制时注意：戴耐酸手套。配制方法：先将重铬酸钾溶于水，然后缓慢加入浓硫酸。,4、冲洗,用蒸馏水冲洗35遍。,2.1.2 胶塞的清洗,浸泡于水；2NaOH（或洗衣粉）煮沸1020分钟；自来水冲洗；1稀盐酸浸泡30min，或蒸馏水冲洗后再煮沸1020min，晾干备用。,2.1.3 塑料制品的清洗,脱脂棉轻拭；用水冲洗干净；2NaOH浸泡过夜；自来水冲洗；5盐酸溶液浸泡30min；自来水冲洗；蒸馏水洗。,2.1.4 滤器的清洗,新滤器清洗方法： 清洁液中浸泡24h 然后用流水冲洗 蒸馏水冲洗 烤干使用滤器的清洗方法： 过夜水中浸泡 流水冲洗至滤面疏通 50度烤干 清洁液中浸泡24小时 蒸馏水冲洗 烤干 包装 消毒,2.1.5 包装,组织培养的器皿要清洗、晾干；消毒前必须进行严密包装，以便消毒及储存，同时防止落入灰尘及消毒后被再次污染。,2.2 消毒,控制污染是细胞培养的关键环节；污染主要原因：A.操作不当； B.器皿和培养液消毒不合 格,物理消毒,化学消毒,高温高压、烘烤或灼烧、过滤（0.25m）、紫外线、超声波等。,使用灭菌剂，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。,2.2.1 物理灭菌法,1. 紫外线消毒 应用范围：超净台 少数培养器皿 消毒对象：大部分细菌，真菌抵抗力 强；革兰氏阴性菌最为敏感。,消毒原理：破坏微生物的核酸和蛋白质等而 使其灭活（直接作用）。 紫外线产生的臭氧杀死微生物 （间接作用）。消毒范围：距地面不超过2.5米，消毒物品不 能互相遮挡。超净台消毒灯距台 面距离不应超过1.5米消毒时间：30min左右；,注意事项：紫外线对人皮肤、眼睛都有伤害；紫外线可产生臭氧，污染空气。,2.湿热消毒 高压蒸汽消毒，最广泛，效果最好的消毒方法。高压灭菌锅：培养基、工具等的灭菌根据大小分为：小型、中型、大型有全自动、手动之分。,培养基、器具等的灭菌一般120，灭菌30分钟。灭菌锅有自动和手动之分。 自动锅加足水后，调好时间、温度，即可自动运转。 手动锅加足水后，关好，通电。待压力升到0.5 kg/cm2时，打开排气阀排除锅内冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1 kg/cm2 (120左右) 时计时, 用通电、断电来保持20分钟。待降至压力为0后取出。,手动灭菌锅,安全阀,放气阀,压力表,全自动灭菌锅,玻璃器皿消毒条件：121.3（101.3kPa），20 min；培养液及橡胶制品：115（65kPa），10 min,3. 干热消毒 主要用来消毒玻璃器皿。 用电热烤箱将物品加热到160以上，并保持90120min，以杀死细菌。 注意：不可骤冷。灼烧也是干热消毒灭菌方法之一，快捷方便，通常金属器具和玻璃口缘。,5.过滤除菌 用滤器和微孔滤膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。,过滤灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇高温分解，就需要过滤灭菌或者二者结合。 另外酶等也需过滤灭菌。 灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过滤，0.2-0.25m。制培养基时，先将培养基高压灭菌，待降至50左右时，加入适量的激素，然后分装。,2.2.2 化学消毒法,利用化学试剂消毒那些不能用来进行物理消毒的物品和器具。常用消毒剂有：75酒精、2戊二醛,2.3 培养基及其配制,一、培养基的成分及作用 在离体条件下，植物组织良好的营养要求，随植物种类而变化。 培养基种类有很多（实验指导书的后面附表），但一般可包括如下几部分：,1.无机营养成分 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶及酶的活化剂，参与植物代谢活动；三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、电荷平衡等生物电化学等方面的作用；四是发育过程中，影响组织器官的建成。,2、有机营养成分 糖（蔗糖）： 糖在培养基中的作用：1）.为细胞提供合成新物质的炭骨架。2）.为细胞的呼吸代谢提供底物与能源。3）.维持培养基的渗透压。 维生素：为使培养物生长的更好，可以根据培养目的添加一种或多种维生素：硫胺素（VB1）、烟酸(Vpp)、泛酸钙(VB5)、吡哆醇(VB6)、钴胺素(VB12)、叶酸(VBc)、抗坏血酸(VC)等。,氨基酸：是蛋白质的组成成分。常用的是甘氨酸及多种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 肌醇：又称环己六醇，在糖类的互相转化中起作用。根据培养植物不同，是否添加。 腺嘌呤：是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌呤有利于细胞自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。,3、 琼脂 固化剂，使培养基凝固。,4、植物激素 自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。 在组织培养中，培养基中各种成分对培养物影响最大、最显著的是激素。激素的种类、浓度以及配比会显著影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。,通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大变化。这主要决定于植物的内源激素水平组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如2,4-D等。,生长素类,细胞分裂素类,赤霉素,脱落酸,激素种类,1.生长素类 自然界中，即内源生长素影响茎和茎节的伸长、向光性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。 在组织培养中，生长素被用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。,二氯本氧乙酸 (2,4-D)三氯苯氧乙酸 (2,4,5-T)萘乙酸 (NAA)吲哚乙酸 (IAA)吲哚-3-丁酸 (IBA)萘氧乙酸 (NOA)对氯苯氧乙酸 (P-CPA)溶解方法：0.1 M NaOH 或95% 酒精，以前者为好。保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。,愈伤组织的诱导和生长,引起生根,组织培养中常用的生长素有：,2细胞分裂素类(嘌呤族衍生物) 自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等 组织培养中，细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的细胞分裂素有：激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素 (Zeatin、zt)6-苄基嘌呤 (BAP)异戊烯氨基嘌呤 (2-ip)溶解方法：0.1 M HCl保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。,3赤霉素自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3。在组织培养中，赤霉素不太常用。据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成小植株，以及促进不定芽伸长。溶解方法：95% 酒精。保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解。 灭菌：高温分解，过滤灭菌。,4、 脱落酸(ABA)组织培养中，经实验表明，ABA有利于胚性愈伤组织形成正常不定胚。材料的试管保存，加上ABA能抑制生长，使继代培养时间延长。溶解方法：95% 酒精。保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。,在组织培养中添加激素的种类、浓度、配比等微小的变化都会显著影响植株再生。在实验中可以参考前人的结果，但若某种植物尚无报道，就需摸索。,二、几种常用培养基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBM、米勒、改良怀特、尼许、努森C等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡。,三、培养基的配制（一）、贮备液（母液）的配制与保存为什么配母液?1）.方便 2）.准确（有些成分量太小）3）.母液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀。,贮备液(大量元素) 10倍贮备液（微量元素） 100倍贮备液（铁盐） 100倍贮备液（有机成分） 100倍,表 MS培养基母液的配制成分 培养基 每升母液 母液扩 每升培养 配方(mg/L) 用量(mg) 大倍数 基用量(ml)大量元素(母液)KNO3 1900 19000NH4NO3 1650 16500MgSO47H2O 370 3700 10 100 KH2PO4 170 1700 CaCl22H2O 440 4400,微量元素(母液II)MnSO44H2O 22.3 2230ZnSO47H2O 8.6 860H3BO3 6.2 620 KI 0.83 83 100 10Na2MoO42H2O 0.25 25CuSO45H2O 0.025 2.5CoCl26H2O 0.025 2.5,铁盐(母液)FeSO47H2O 27.85 2785 100 10Na2EDTA2H2O 37.25 3725,有机成分(母液)甘氨酸 2 200盐酸硫胺素 0.4 40 100 10盐酸吡多素 0.5 50烟酸 0.5 50肌醇 100 10000,母液、按表称量药品 溶解 定容 冰箱4保存。母液，FeSO47H2O和Na2EDTA称量后，分别溶于水中，加热，然后混合一起，冷却