结核病实验室诊断技术新进展(2)

1 结核病实验室诊断技术进展 2 1 细菌学方法2 免疫学方法3 分子生物学方法 2 主要内容 岳玉瑛 Tel 小号 651739邮箱 根据 伯杰氏细菌鉴定手册 M TB分为四型 人型 主要致病菌 90 以上 牛型 未经严格消毒的牛奶非洲型 非洲病人痰标本中分离出来鼠型 感染野鼠 对人不致病由于性状上和基因组的相关性 以上四种常称为结核分枝杆菌复合群前型三种能对人致病 一 形态与染色 形态 细长 弯曲 两端圆形杆菌大小 0 3 0 6 1 4 m染色 抗酸染色阳性 红色 抗酸杆菌 二 菌体成分 类脂质 占总量50 60 蜡质50 组织坏死 干酪液化 空洞迟发型超敏反应蛋白质 组织坏死和全身中毒症状 形成结核结节多糖类 血清反应等免疫应答有关 好吃 懒做 顽固 善变 三 生物学特性 好吃 懒做 顽固 善变 三 生物学特性 三 生物学特性1 条件性 需氧 37 特殊培养基 肺2 懒惰性 生长慢 无运动能力 四个特性 1 条件性 需氧 37 特殊培养基 肺2 懒惰性 生长慢 无运动能力 好吃 懒做 一个结核菌进入人体后的繁殖情况 四个特性 1 条件性 需氧 37 特殊培养基 肺 骨骼两端2 懒惰性 生长慢 无运动能力3 顽固性 抵抗力强 好吃 懒做 顽固 四不怕 干燥 干燥痰中存活6 8月寒冷 在 7 以下可生存4 5年酸 碱 一般的消毒剂难以渗入 通常的灭菌方法易失败 对酸 3 HCl或6 H2SO4 或碱 4 NaOH 有抵抗力 15分钟不受影响 可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质 青霉素等抗生素 四怕 乙醇 醇脂性溶剂 酒精能渗入其酯层而发挥奇效 用75 酒精2分钟便可将它杀死 紫外线 直接日光照射数小时可被杀死 可用于结核患者衣服 书籍等的消毒 湿热 液体中加热70 10分钟 95 1分钟即可死亡抗痨药物 异烟肼 利福平 吡嗪酰胺 乙胺丁醇 链霉素等敏感 四怕 紫外线乙醇煮沸抗痨药物 四不怕 干燥 寒冷酸 碱碱性染料青霉素等抗生素 四个特性 1 条件性 需氧 37 特殊培养基 肺 骨骼两端2 懒惰性 生长慢 无运动能力3 顽固性 抵抗力强4 变异性 形态 菌落 毒力 免疫原性 耐药性变异 好吃 懒做 顽固 善变 17 1 细菌学方法 抗酸染色 固体或液体培养 17 痰结核分枝杆菌检查 确诊 指导化疗方案 考核疗效的主要依据 痰涂片检查及分枝杆菌分离培养 每例初诊患者应至少涂片检查3份痰标本 有条件的单位应进行结核分枝杆菌培养检查 痰涂片镜检结果 涂 涂 培 培 痰涂片镜检结果 抗酸杆菌阴性 连续观察300个不同视野 未发现抗酸杆菌 抗酸杆菌阳性 报告抗酸杆菌菌数 1 8条 300视野 抗酸杆菌阳性 1 3 9条 100视野 抗酸杆菌阳性 2 1 9条 10视野 抗酸杆菌阳性 3 1 9条 每视野 抗酸杆菌阳性 4 10条 每视野 20 噬菌体裂解试验 该法1997建立 并用于结核分枝杆菌耐药性测定 近来还被用于肺结核患者痰标本的快速检测 21 用于痰标本快速检测 MTB标本 反应5分钟 反应1小时 培养24小时 加入杀毒剂 加入指示细胞 22 结果观察 阳性阴性阳性可见有数量不等的噬菌斑 或许多噬菌斑相互融合成透明状 阴性结果无噬菌斑出现 23 室温5分钟 37 1小时 18 24小时 加入杀毒剂 加入培养基和指示细胞 药物 结核菌 24 48小时 加入噬菌体 MTB MTB 用于药敏试验 24 敏感株结果 不含药 含药 25 耐药株结果 不含药 含药 26 2 免疫学检测技术 原理 MTB感染人体后会刺激机体产生相应的免疫应答 检测免疫应答产物可作为肺结核诊断的旁证 有助于结核病的诊断和鉴别诊断 结核抗体检测结核抗原检测 27 结核抗体测定 用已知的结核抗原来检测待检标本中的未知的结核抗体 有助于结核病的诊断和鉴别诊断 还作为组织器官移植结核感染的监测指标 酶联免疫吸附免疫渗滤试验免疫层析试验 28 酶联免疫吸附免疫渗滤试验 酶标金标 免疫层析试验 29 结核蛋白芯片检测 其原理是将结核杆菌多种特异性蛋白抗原固定在玻片上 然后与待测样本的抗体结合 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息 由于该法同时将大量蛋白固定于支持物上 所以一次可以检测许多种抗体 30 31 结核抗体检测适用范围 痰菌阴性的临床高度疑似活动性肺结核病患者的辅助诊断 活动性肺结核与其它疾病的辅助鉴别诊断 临床高度疑似的肺外结核患者的辅助诊断 健康人群体检 筛选可疑结核病患者 32 结核抗原测定 由于机体受到结核杆菌感染后 体内首先出现的是结核抗原 因此检测结核抗原具有早期诊断价值 菌阴肺结核诊断 肺外结核诊断 33 检测用的抗原 ESAT 6蛋白和CFP 10抗原因为这二种蛋白只存在于结核分枝杆菌复合群中 BCG和大部分非结核分枝杆菌缺失 因此 本法可区别结核感染者和BCG接种者 34 TB抗原ELISA检测试剂盒 2小时出结果定量检测数种分泌性抗原准确度达90 以上已在欧 美 日本等多国家进行专利申请中 35 35 35 2 免疫学方法 干扰素释放实验 36 3 分子生物学诊断技术 线性探针杂交 HainLPA 基因芯片 Genechip 实时荧光PCR探针溶解曲线法GeneXpert 实时荧光PCR技术 LAMP 环介导等温扩增技术 交叉引物法RNA等温扩增法 36 37 线性探针技术 37 DNA提取用NALC NaOH处理痰标本 2 PCR扩增 3 杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交 4 结果判读 38 杂交试剂 39 40 MTBDRplus反应条带 示范 40 41 线性探针技术 标本 菌株 涂阳痰标本 时间 较短 8小时 操作简单 条件 实验室通过临床基因扩增实验室认证要求严格分区 41 42 线性探针技术 应用 耐多药结核病筛查 42 4省的4个地市级评估数据 43 基因芯片 指采用光导原位合成或微量点样等方法 将核酸片段有序地固化于支持物 如玻片 硅片 聚丙烯酰胺凝胶 尼龙膜等载体 的表面 组成密集二维分子排列 然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机 CCD 对杂交信号的强度进行快速 并行 高效地检测分析 从而判断样品中靶分子的数量 44 基因芯片 44 45 45 基因芯片 46 基因芯片 46 47 基因芯片 应用 耐多药结核病筛查 国内在4个省的4个地市级评估 47 48 实时PCR探针熔解曲线法 原理 荧光定量PCR法检测利福平 异烟肼 链霉素 乙胺丁醇等耐药性 核酸提取0 5小时 耐药检测时间2小时 Tm值 DNA熔解温度 48 49 Wild type Mutant type Mutant Wild type 探针熔解曲线工作原理 在一定环境下 DNA双链在其长度和序列一定时 Tm值也一定 是其固有性质 当发生错配时 Tm值下降 下降的幅度与发生错配的碱基数目 类型和位置有关 匹配度最好时 Tm值最高 发生错配后 Tm值下降 既有野生又有突变时 出现两个熔解峰 探针游离时为淬灭状态 50 操作流程 样品提取 PCR反应液配制 加样 上机 结果分析 在配液区 将PCRMix与Taq酶混合混匀后 分装入PCR反应管中 盖好后转移到样品提取区 在提取区 将痰标本按照说明书要求 以Lab Aid820核酸提取系统提取模板DNA 每个样品的反应管A B中分别加入模板5uL 在提取区盖好管盖后 进入扩增区上机运行扩增和熔解曲线分析程序 操作软件 选择荧光通道和样本位置 读取和分析结果 51 耐药相关基因位点 52 特点 灵敏度 102 103菌 mL特异性 与常见NTM及呼吸道细菌无交叉反应不均一耐药检出 10 40 野生型符合率 100 参考品 突变型符合率 100 参考品 精密性 Tm值波动范围不超过 1 53 MeltProTM试剂盒临床试验结果 此外 在沈阳胸科医院 广州胸科医院 上海肺科医院 山东省胸科医院 河南省CDC 厦门市CDC 重庆公卫中心 浙江省CDC 乌鲁木齐胸科医院 北京胸科医院等单位进行临床应用或验证 均获得满意结果 54 GeneXpert 实时PCR技术GeneXpert系统由美国Cepheid公司研发 完全整合了系统PCR检测所需的三个步骤 样品的准备以及核酸的提取被提取核酸的扩增目标序列的检测 54 55 操作步骤 56 特色 时间 2个小时安全性 直接用痰标本 密闭体系中反应 生物安全性好 简便性 痰标本 标本制备 扩增 检测一体自动化易操作 系统软件实时监测PCR进行情况 一旦PCR完成自动给出实验结果 56 57 GeneXpert 注册 设备通过国内SFDA注册现场评估 4个区县级实验室 57 58 58 环介导等温扩增技术 Loopmediatedisothermalamplification LAMP Eiken Japan 用一套四 用一套四条特异性引物 两对外部引物和两对内部引物 与靶基因的六个不同区域退火杂交 在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件扩增DNA分子的核算扩展技术 59 59 59 LAMP 60 可同时检测患者是否感染结核所用仪器设备极其简单63 扩增 避免非特异性扩增 多对引物 提高特异性和速度 靶基因6个不同区域 设计4种引物 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 密闭系统 没有污染的风险 快速 两小时内即可得到检测结果 肉眼观察 61 交叉引物法 61 检测原理取痰液或支气管冲洗液等临床标本 经液化处理 煮沸离心提取DNA模板 用交叉引物扩增技术 CPA 在63 恒温下完成结核分枝杆菌DNA的扩增和杂交 然后在密闭的一次性核酸检测装置中用免疫层析乳胶标记试纸条定性检测扩增产物 62 试剂盒A 小盒 CPA玻璃化试剂DNA提取液ddH2O 阴性对照 阳性对照复溶缓冲液石蜡油试剂盒B 大盒 一次性核酸检测装置备用液泡 结核分枝杆菌 TB 核酸检测试剂盒 恒温扩增 试纸条法 63 检测流程 恒温金属浴 1 核酸提取 2 恒温扩增 3 快速检测 64 结果的判读 阳性 试纸条出现两条红色条带 一条位于质控区 C线 一条位于检测区 T线 表明样本中含有结核分枝杆菌 且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限 阴性 试纸条质控区 C线 出现一条红色条带 检测区 T线 没有条带 表明样本中不含结核分枝杆菌 或其水平低于本试剂盒的最低检出限 无效 试纸条质控区 C线 未出现条带 表明试剂盒已损坏 失效或者操作有误 65 结论 用于初诊患者初筛良好的检测效能 时间短 无仪器 灵敏度特异性高用于涂阴肺结核患者检测显著提高对涂阴肺结核患者的检出率 66 RNA等温扩增法 将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术 SAT技术 特异性检测结核分枝杆菌16SrRNA 同时采用了新型的超声破碎结核分枝杆菌的方法 准确 快速地提供结核病的诊断依据 66 67 特点1 准确高灵敏度 阳性检出率高于涂片 固体培养 液体培养 准确度高于 金标准 固体培养 高特异性 97 85 100 2 快速 简便2小时超声波处理结核菌 操作更为简单 易掌握 3 活菌检测 为临床的治疗效果提供参考依据核糖体RNA rRNA 是结核分枝杆菌活菌的标志 意义 阴性的意义 表示未受结核菌感染 某些情况下不排除已受结核菌感染 如变态反应前期 患急性传染病 发热 使用免疫抑制剂等 免疫功能低下如重症结核病 慢性消耗性疾病 肿瘤 艾滋病 高龄等 阴性也不表示没有结核感染 值得注意的是假阴性情况 在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴性 这种情况常见于以下疾病 初次感染结核菌4 8周以内 重度营养不良 恶性肿瘤 机体免疫缺陷性疾病 先天性免疫缺陷症 艾滋病 免疫抑制剂使用者等 个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性反应 婴幼儿PPD试验阴性应该及时接种卡介苗 阳性的意义 阳性表示曾感染结核 不一定现在患病 1 一般阳性和中度阳性 结核病现症患者 已受结核菌感染但并不意味着发病或患病 卡介苗接种所致变态反应 3岁内未接种卡介苗者提示体内存在结核病灶 应及时进行结核菌检查 影像学检查 血沉等检查以确定诊断和治疗 2 强阳性 1 结核病患者 2 感染结核菌未发病者 强阳性人群结核病的发病率高 在未找到病变时可作预防性治疗 3 如果2年内PPD试验结果由阴性 转为阳性 或反应强度从原来硬结直径10mm 提示新近