第一章蛋白质化学(生科)

第一章蛋白质化学 第一节蛋白质的生物学意义 第二节蛋白质的分子组成 第三节肽 是氨基酸的线性聚合物 第四节蛋白质的分子结构 第五节蛋白质结构与功能的关系 第六节蛋白质的理化性质 第七节蛋白质的分类 第八节蛋白质的分离 纯化与一级结构的测定 第一节蛋白质的生物学意义 一 蛋白质是生命活动的物质基础 或者说蛋白质是生物体的结构物质 分布广 含量高 所有的器官 组织都含有蛋白质 细胞的各个部分都含有蛋白质 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 占人体干重的45 某些组织含量更高 例如 脾 肺 横纹肌等含量可高达80 激素 血红蛋白 肌蛋白 免疫球蛋白 二 蛋白质是生物体的功能物质 蛋白质的生物学功能 酶 1 作为生物催化剂 2 调节代谢反应 3 运输载体 4 参与机体的运动 5 参与机体的防御 6 接受传递信息 味觉蛋白 视觉蛋白 7 调控细胞的生长 分化 遗传信息的表达 8 其它 第二节蛋白质的分子组成 一 元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物 一 主要元素 C 50 55 H 6 5 7 3 O 19 24 N 16 S 0 3 某些蛋白质还含有其他一些元素 主要是磷 铁 碘 钼 锌和铜等 蛋白质的含氮量 大多数蛋白质的含氮量接近于16 这是蛋白质元素组成的一个特点 也是凯氏 Kjedahl 定氮法测定蛋白质含量的计算基础 所以 可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量 蛋白质含量 6 25 样品含氮量6 25为蛋白质系数 即1克氮所代表的蛋白质量 克数 河北石家庄三鹿集团所产的三鹿婴幼儿奶粉三聚氰胺 melamine 是一种有机含氮杂环化合物 是一种重要的化工原料 主要用途是与醛缩合 生成三聚氰胺 甲醛树脂 生产塑料三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高 66 加之其生产工艺简单 成本很低 将三聚氰胺加入奶粉中 可 增加 产品的表观蛋白质含量 因为 三聚氰胺作为一种白色结晶粉末 没有什么气味和味道 掺杂后不易被发现 给人造成假象 久用导致蛋白质缺乏 营养不良 长期饮用蛋白质含量极低的奶粉 首先会导致婴儿严重营养不良 随后会引起各种并发症 在外来细菌的侵袭之下 婴儿几乎完全丧失了自身的免疫能力 病情发展十分迅速 最后婴头部严重水肿 几乎看不清五官 全身皮肤也出现了大面积的高度溃烂 伤口长时间无法愈合 最后导致呼吸衰竭而死亡 二 组成蛋白质的基本单位 氨基酸 氨基酸是蛋白质的基本组成单位 从细菌到人类 通过酸水解 碱水解 酶解等方法证明所有蛋白质都由20种标准氨基酸 20standardaminoacids 组成 一 蛋白质的水解 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解 酸或碱能够将多肽完全水解 酶水解一般是部分水解 1 酸水解 常用6mol L的盐酸或4mol L的硫酸在105 110 条件下进行水解 反应时间约20小时 优点 不容易引起水解产物的消旋化 得到的是L 氨基酸 缺点 某些氨基酸被破坏 如色氨酸被沸酸完全破坏 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解 天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成羧基 2 碱水解 一般用5mol L氢氧化钠煮沸10 20小时 优点 色氨酸在水解中不受破坏 缺点 产率低 原因是水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏 部分的水解产物发生消旋化 其产物是D 型和L 型氨基酸的混合物 3 酶水解 水解蛋白的酶 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶 proteolyticenzyme 或称蛋白酶 proteinase 已有十多种 最常见的蛋白水解酶有以下几种 胰蛋白酶 糜蛋白酶 胃蛋白酶 嗜热菌蛋白酶 优点 不会破坏氨基酸 也不会发生消旋化 水解的产物为较小的肽段 二 氨基酸的结构与分类 结构通式 1 氨基酸的结构 甘氨酸Glycine 脂肪族氨基酸 1 常见氨基酸的结构 丙氨酸Alanine 缬氨酸Valine 亮氨酸Leucine 异亮氨酸Ileucine R 脂肪烃基 亚氨基酸 脯氨酸Proline 含硫氨基酸 甲硫氨酸Methionine 半胱氨酸Cysteine 芳香族氨基酸 苯丙氨酸Phenylalanine 酪氨酸Tyrosine 色氨酸TryptophanTrp 碱性氨基酸 精氨酸Arginine 赖氨酸Lysine 组氨酸Histidine 酸性氨基酸 天冬氨酸Aspartate 谷氨酸Glutamate 含羟基氨基酸 丝氨酸Serine 苏氨酸Threonine 含酰胺氨基酸 天冬酰胺Asparagine Asn 谷氨酰胺Glutamine GIn 2 蛋白质中几种重要的稀有氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸 通常称为不常见蛋白质氨基酸 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的 其中重要的有4 羟基脯氨酸 5 羟基赖氨酸 N 甲基赖氨酸和3 5 二碘酪氨酸等 这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下 3 非蛋白氨基酸 鸟氨酸 瓜氨酸 2 氨基酸的分类 1 根据来源分 内源氨基酸和外源氨基酸2 从营养学角度分 非必需氨基酸 12种 必需氨基酸 8种 IleMetValLeuTrpPheThrLys 3 根据是否组成蛋白质来分 蛋白质中常见氨基酸 蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸 异亮甲硫缬亮色苯丙苏赖 4 根据R基侧链来分 脂肪族氨基酸 疏水性 芳香族氨基酸 杂环亚氨基酸 Pro 脯氨酸 根据R的化学结构 Gly 甘氨酸 Ala 丙氨酸 Val 缬氨酸 Leu 亮氨酸 Ile 异亮氨酸 Met 甲硫氨酸 Cys半胱氨酸 Arg 精氨酸 Lys 赖氨酸 Asp 天冬氨酸 Glu 谷氨酸 Asn 天冬酰胺 Gln 谷氨酰胺 Ser 丝氨酸 Thr 苏氨酸 极性 Phe 苯丙氨酸 Tyr 酪氨酸 杂环氨基酸 Trp 色氨酸 His 组氨酸 根据R的极性 极性氨基酸 不带电 Thr Ser Asn Gln Tyr Cys 带正电 His Lys Arg 带负电 Asp Glu 非极性氨基酸 Gly Ala Val Leu Ile Phe Met Pro Trp 根据氨基酸的结构或性质巧记20种常见的氨基酸 甘丙缬亮异脂链 丝苏半甲羟硫添 天谷精赖组酸碱 脯酪苯色杂芳环 门冬酰胺谷酰胺 都有 密码 属常见 1 请回答下列三字符缩写所代表的氨基酸名称 课前复习 2 请指出表中的氨基酸哪些是酸性氨基酸 哪些是碱性氨基酸 为什么 3 在氨基酸结构通式中决定氨基酸种类的关键基团是什么 3 氨基酸的重要理化性质 1 一般的物理性质 教材无 2 氨基酸的两性解离和等电点 3 氨基酸的化学反应 1 一般的物理性质 氨基酸具有旋光性除甘氨酸外 氨基酸含有一个手性 碳原子 因此都具有旋光性 左旋 或右旋 L 构型与D 构型构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外 均含有 碳原子 在空间各原子有两种排列方式 它们的关系就像左右手的关系或镜像关系 氨基酸的光吸收 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区无光吸收能力 在远紫外区 220nm 均有光吸收能力 在近紫外区 220 300nm 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色 氨酸有吸收光的能力 酪氨酸的 max 275nm 苯丙氨酸的 max 257nm 色氨酸的 max 280nm 高熔点 一般都大于200oC 超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳 溶解度 一般均溶于水 溶于稀酸或稀碱中 不溶于乙醚 丙酮 醇等有机溶剂 氨基酸一般有味 如Lys 形态 均为白色结晶或粉末 不同氨基酸的晶型结构不同 2 氨基酸的两性解离与等电点 氨基酸是两性电解质 氨基酸的解离与等电点 氨基酸在结晶形态或在水溶液中 并不是以游离的羧基或氨基形式存在 而是离解成两性离子 在两性离子中 氨基是以质子化 NH3 形式存在 羧基是以离解状态 COO 存在 在不同的pH条件下 两性离子的状态也随之发生变化 氨基酸的解离 水溶液或晶体形态 从上图可知 氨基酸在酸性环境中 主要以阳离子的形式存在 在碱性环境中 主要以阴离子的形式存在 在某一pH环境下 以两性离子 兼性离子 的形式存在 该pH称为该氨基酸的等电点 所以氨基酸的等电点 PI 可以定义为 氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH 等点电时氨基酸处于两性离子状态 溶解度最低 易沉淀 带电状态判定pI pH 0 pH pI 带正电pI pH 0 pH pI 带负电pI pH 0 pH pI 不带电 氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH为该氨基酸的等电点 等点电时氨基酸的溶解度最低 易沉淀 3 氨基酸等电点的计算 中性氨基酸 图 甘氨酸电离酸碱度曲线 氨基酸的等电点决定于两性离子两边的pK值的算术平均值 3 氨基酸等电点的计算 谷氨酸的解离 请根据谷氨酸的解离方程和解离曲线所给出的数值计算谷氨酸的等电点 组氨酸解离 Tyr 氨基酸两性解离及等电点的应用 分离或制备氨基酸 小结 1 氨基酸所带正负电荷相等时的溶液pH为该氨基酸的等电点 用PI表示 2 PI值决定两性离子两侧的PK值 与离子浓度无关 5 中性氨基酸的等电点小于7 pH在6左右 酸性氨基酸的等电点较低 pH在2左右 碱性氨基酸的等电点较高 pH在9左右 6 氨基酸溶液的PH离等电点愈远 氨基酸所带的净电荷愈大 3 在计算PI时 首先要写出氨基酸的解离方程 然后取兼性离子两边的PK值的平均值 4 高于等电点的pH溶液 氨基酸带净负电荷 低于等电点的pH溶液 氨基酸带净正电荷 PI PH时 氨基酸所带正负电荷相等 净电荷为零 亚硝酸盐反应烃基化反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应 成盐成酯反应成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应 侧链反应 3 氨基酸的化学反应 茚三酮反应 氨基和 羧基共同参加的反应 反应灵敏 用于氨基酸的定性定量分析 与亚硝酸反应 脯氨酸除外 放出氮气 氮气的一半来自氨基氮 一半来自亚硝酸 在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量 此反应可用于测定蛋白质的水解程度 与甲醛的反应用过量的中性甲醛与氨基酸反应 可游离出氢离子 然后用NaOH滴定 从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量 此法称为间接滴定法 用途 可以用来直接测定氨基酸的浓度判断蛋白质的水解程度或合成进度 与2 4 二硝基氟苯 2 4 DNFB 的反应 烃基化反应 O2N NO2 F H2N CH COOH O2N NO2 HN R CH R COOH HF DNFB 黄色二硝基苯 氨基酸 DNP 氨基酸 用途 DNP 氨基酸十分稳定 用乙醚抽提后可通过层析加以鉴定 所以 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 亦称Sanger反应 与苯异硫氰酸酯 PITC 反应 Edman反应 苯硫乙内酰脲氨基酸 PTH 氨基酸 苯异硫氰酸酯 苯氨基硫甲酰 氨基酸 PTC 氨基酸 弱碱 在硝基甲烷中与酸作用发生环化 PTH 氨基酸在酸中极稳定 经乙酰乙酯抽提后 可用层析法加以分离鉴定 用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸 与丹磺酰氯 DNS Cl 的反应 生成荧光物质DNS 氨基酸 均可用于蛋白质的N 末端的测定 氨基酸与2 4 二硝基氟苯 2 4 DNFB 的反应 烃基化反应 氨基酸与苯异硫氰酸酯 PITC 反应 Edman反应 生成苯乙内酰硫脲 氨基酸 氨基酸与丹磺酰氯 DNS Cl 的反应 生成荧光物质DNS 氨基酸 第三节肽 是氨基酸的线性聚合物 一 肽的概念 一 肽键与肽链肽键 1 两个氨基酸组成的肽叫二肽 2 三个氨基酸组成的肽叫三肽 3 多个氨基酸组成的肽叫多肽 4 氨基酸借肽键连成长链 称为肽链 肽链两端有自由 NH2和 COOH 自由 NH2端称为N 末端 氨基末端 自由 COOH端称为C 末端 羧基末端 5 构成肽链的氨基酸已残缺不全 称为氨基酸残基 6 肽链中的氨基酸的排列顺序 一般 NH2端开始 由N指向C 即多肽链有方向性 N端为头 C端为尾 丝氨酸残基 甘氨酸残基 酪氨酸残基 亮氨酸残基 二 天然活性肽 在生物体中 多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位 但是 也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在 这类多肽通常都具有特殊的生理功能 常称为活性肽 activepeptide 如 脑啡肽 激素类多肽 抗生素类多肽 谷胱甘肽 蛇毒多肽等 二 几种生物活性肽 一 谷胱甘肽 GSH 细胞内重要的还原剂 是某些酶的辅酶 在体内氧化还原反应中起重要作用 谷胱甘肽的生理功用 解毒作用 与毒物或药物结合 消除其毒性作用 参与氧化还原反应 作为重要的还原剂 参与体内多种氧化还原反应 保护巯基酶的活性 使巯基酶的活性基团 SH维持还原状态 维持红细胞膜结构的稳定 消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用 GSH过氧化物酶 GSH还原酶 NADPH H NADP 激素类多肽 牛催产素 九肽 牛加压素 九肽 L Leu D Phe L Pro L Val L OrnL Orn L Val L Pro D Phe L Leu短杆菌肽S 环十肽 由细菌分泌的多肽 有时也都含有D 氨基酸和一些非蛋白氨基酸 如鸟氨酸 Ornithine 缩写为Orn 结课 思考题 3 采用纸层析技术将混合的氨基酸分离后 怎样鉴定被分离的氨基酸是何种氨基酸 1 根据上节课的学习 请同学们思考并回答氨基酸的哪些性质可以用于蛋白质N端的测定 氨基酸的 氨基与2 4 二硝基氟苯反应生成黄色稳定的2 4 二硝基苯氨基酸 与苯异硫氰酸酯反应生成苯硫乙内酰脲氨基酸 与丹磺酰氯反应生成荧光物质 均可用于蛋白质 末端的测定 第四节蛋白质的分子结构 蛋白质的结构具有多种结构层次 包括一级结构和空间结构 空间结构又称为构象 空间结构包括二级结构 三级结构和四级结构 在二级与三级之间还存在超二级结构和结构域这两个结构层次 蛋白质的化学定义 蛋白质都是多肽 是由一条或一条以上的多肽链按特有的结构方式组合而成的特殊的大分子多聚物 4 蛋白质的长链的空间排布 高级结构 蛋白质结构研究的内容 1 蛋白质的组成 2 蛋白质中氨基酸之间的连接方式 即化学键的本质 3 蛋白质所含氨基酸的排列顺序 初级结构 一 蛋白质的一级结构 一 蛋白质的一级结构 共价结构或化学结构 的定义 指蛋白质中氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构 在基因编码的蛋白质中 这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础 二 一级结构举例 二 蛋白质的空间结构 空间构象 构型与构象 构型 指一个不对称的化合物中不对称中心上的几个原子或基团的空间排布方式 如单糖的 构型 氨基酸的D L 构型 构象 指一个分子结构中的一切原子绕共价单键旋转时产生的不同空间排列方式 构型的改变 会涉及共价键的形成或破坏 构象的改变不涉及共价键的形成或破坏 二者的根本区别 一 蛋白质的二级结构 肽平面 肽链空间构象的基本结构单位 肽平面由组成肽基 CO NH 的4个原子和两个相邻的Ca原子组成 1 二级结构的概念 蛋白质多肽链在一级结构的基础上 按照一定的方式有规律的旋转或折叠形成的空间构象 实质是多肽链主链在空间的排列方式 2 蛋白质分子构象的立体化学原则 多肽链折叠的空间限制 肽键上的原子呈反式构型 肽键C N键长为0 132nm 比一般的C N单键 0 147nm 短 比C N双键 0 128nm 要长 具有部分双键的性质 不能旋转 肽链主链上只有C C Ca NH2 为真正单键 可以旋转 相邻肽平面构成二面角 一个C 原子相连的两个肽平面 由于N C 和C C 羧基碳 两个键为单键 肽平面可以分别围绕这两个键旋转 从而构成不同的构象 一个肽平面围绕N C 氮原子与 碳原子 旋转的角度 用 表示 另一个肽平面围绕C C 碳原子与羧基碳 旋转的角度 用 表示 这两个旋转角度叫二面角 3 蛋白质二级结构的主要类型 蛋白质的构象单元 1 a 螺旋 a Helix 2 折叠 pleatedsheets 3 转角 5 无规则卷曲 4 凸起 螺旋 helix 为蛋白质主链的一种典型结构形式 见于纤维状蛋白和球蛋白 结构要点 多个肽键平面通过 碳原子旋转 主链绕一条假想的固定轴形成右手螺旋 螺旋 3 613 螺旋 每3 6个氨基酸残基上升一圈 螺距是0 54nm 每个氨基酸残基的垂直距离是0 15nm 螺旋 helix 链内氢健是稳定 螺旋的主要键 为重要的作用力 由氢键封闭形成的环含有13个原子 因此被称为3 613螺旋 肽链中氨基酸侧链R 分布在螺旋外侧 其形状 大小及电荷影响 螺旋的形成 天然蛋白质大多数为右手螺旋 在纤维状蛋白质中占得比例较高 少数蛋白质中有左手螺旋 除3 613螺旋外 还有310 4 416螺旋 1 氢键稳定螺旋结构 2 螺旋的肽平面 3 空间填充模型结构 4 带状结构 螺旋结构示意图 影响 螺旋稳定的因素 甘氨酸的R基为H 空间占位很小 也会影响该处螺旋的稳定 1 同性电荷的影响 酸性或碱性氨基酸集中的区域 由于同电荷相斥 不利于 螺旋形成 2 R基大小的影响 较大的R 如苯丙氨酸 色氨酸 异亮氨酸 集中的区域 也妨碍 螺旋形成 3 脯氨酸的影响 脯氨酸因其 碳原子位于五元环上 不易扭转 加之它是亚氨基酸 不易形成氢键 故不易形成上述 螺旋 4 甘氨酸的影响 折叠 多肽链呈锯齿状 或扇面状 排列成比较伸展的结构 可由多条肽链或一条肽链折叠而成 结构特点 相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0 35nm 侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方 片层间有氢键相连 链间氢键是其主要的作用力 有平行式和反平行式两种 平行式是指相邻的肽链是平行的 所有肽链的N端处于同一端 反平行式是指肽链的N端和C端一顺一倒的排列 平行式的折叠其 119 113 反平行折叠其 139 135 转角 又称 弯曲 回折或发夹结构 指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现180o的回折 回折处的结构就称为 转角 一般由四个连续的氨基酸组成 第一个氨基酸的羧基与第四个氨基酸的氨基形成氢键 也有一些是由第一个氨基酸的羧基与第三个氨基酸的氨基形成氢键 凸起 是在 折叠的2个相邻的氢键中多出一个氨基酸残基 形成一个突起 干扰其氢键配对 无规卷曲 没有一定规律的松散肽链结构 但仍是紧密有序的稳定结构 有更大的任意性通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象 角蛋白 纤维状蛋白质 右 螺旋 三股向左缠绕初原纤维 9 2微原纤维 大原纤维 细胞毛发 二 超二级结构和结构域 1 超二级结构超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用 形成有规则的 在空间上能辨认的二级组合体 是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次 可作为蛋白质的结构单元 组装成结构域或三级结构 也可作为蛋白质结构中有某种特定功能的区域 等 曲折 2 结构域 它的结构层次介于超二级结构和三级结构之间 如图所示 结构域是在超二级结构的基础上进一步盘绕折叠成的近似球状的紧密结构 结构域在空间上彼此分离 各自有部分生物学功能大分子蛋白质的三级结构常由一个或数个结构域缔合而成 较小分子蛋白质分子只有一个结构域 结构域也是其三级结构 丙酮磷酸异构酶 结构域分为全 结构域 全 结构域 结构域不规则小蛋白结构 结课 复习 1 回答几个概念 蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构 超二级结构与结构域 2 维系蛋白质 螺旋和 折叠的主要作用力是什么 作用力发生的位置有何本质区别 3 根据所学内容请判断下列给出的结构模式图属于蛋白质的哪一种结构类型 螺旋 折叠 转角 凸起 无规则卷曲 超二级结构 结构域 三 蛋白质的三级结构 三级结构是指一条多肽链中所有原子的整体空间排布 是包括主 侧链在内的特征性构象 是球状蛋白质的多肽链在二级结构 超二级结构和结构域等结构层次基础上组装而成的完整结构 大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状 在三级结构中 大多数的亲水的R侧基分布于球形结构的表面 而疏水的R侧基分布于球形结构的内部 形成疏水的核心 因此疏水作用力是三级结构的主要作用力 分子表面常有空穴 是结合配体 行使生物学功能的活性部位 肌红蛋白 全a结构蛋白 辅基为血红素 四 蛋白质的四级结构 四级结构的实质是亚基在空间排列的方式 两个或两个以上具有独立的三级结构的多肽链 亚基 彼此借次级键相连 形成一定的空间结构 称为四级结构 具有独立三级结构的多肽链单位 称为亚基或亚单位 subunit 亚基是多肽链通过非共价键联结成的一个相当稳定的单位 亚基可以相同 亦可以不同 亚基独立存在时无生物活力或活力很小 血红蛋白的四级结构 维系蛋白质构象的主要化学键 氢键 离子键 盐键 范德华力 配位键 二硫键 共价键 主要的次级键有 共价键 次级键 化学键 肽键 一级结构 氢键 二硫键 二 三 四级结构 疏水键 盐键 范德华力 三 四级结构 蛋白质分子中的共价键与次级键的分布 蛋白质分子具有多样的生物学功能 需要一定的化学结构 还需要一定的空间构象 第五节蛋白质结构与功能的关系 一级结构是空间构象的基础 RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链 分子中8个Cys的 SH构成4对二硫键 形成具有一定空间构象的蛋白质分子 在蛋白质变性剂 如8mol L的尿素 和一些还原剂 如巯基乙醇 存在下 酶分子中的二硫键全部被还原 酶的空间结构破坏 肽链完全伸展 酶的催化活性完全丧失 当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后 发现酶大部分活性恢复 所有的二硫键准确无误地恢复原来状态 若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式 酶完全丧失活性 这个实验表明 蛋白质的一级结构决定它的空间结构 而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证 一 蛋白质一级结构与功能的关系 核糖核酸酶 2 前体与活性蛋白质一级结构的关系 由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原 pre proinsulin 在合成的时候完全没有活性 当切去N 端的24个氨基酸信号肽 形成84个氨基酸的胰岛素原 proinsulin 胰岛素原也没活性 在包装分泌时 A B链之间的33个氨基酸残基被切除 才形成具有活性的胰岛素 如图 前体与活性蛋白质一级结构的关系 1 同一功能的蛋白质其氨基酸的排列顺序具有种属差异 但与空间结构和活性密切相关的氨基酸残基是高度保守的 2 不同种属间同一功能的蛋白质一级结构上相对应的氨基酸差别越大 其亲缘关系愈远 反之 其亲缘关系愈近 3 种属差异 表 不同哺乳动物的胰岛素分子中的氨基酸的差异 证明 不同种属来源的胰岛素其差异在A链小环的8 9 10和B链30位氨基酸残基 说明这4个氨基酸残基并不影响胰岛素的生物活性 起决定作用的是其一级结构中的相同部分 研究发现在胰岛素一级结构的51个氨基酸中有22个氨基酸是始终不变的 为不同种属来源的胰岛素所共有 如A B链中6个Cys残基的位置始终是不变的 说明不同来源的胰岛素A B链之间都有共同的链接方式 3对二硫键对维持高级结构起着重要作用 表 不同生物与人的细胞色素c相比较的氨基酸数目差异 蛋白质的一级结构与分子病 由于基因结构改变 蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变 从而导致蛋白质功能障碍 出现相应的临床症状 这类遗传性疾病称为分子病 现知几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关 经典举例 镰形细胞贫血症 编码血红蛋白 链的结构基因第六个密码子由CTT CAT 相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由Glu Vla 由于谷氨酸在生理条件下带负电荷 使正常血红蛋白相互排斥 不能聚集 缬氨酸为疏水氨基酸 氨基酸的改变 使其空间结构发生相应改变 在表面形成互补区 使蛋白质分子之间彼此聚合 促使红细胞在低氧压下变形成镰形 丧失运输氧的生物活性 镰状细胞贫血 sick cellanemia 从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞 链1234567Hb AN Val His Leu Thr Pro Glu Lys Hb SN Val His Leu Thr Pro Val Lys 镰状细胞贫血临床症状 细胞形态改变 镰刀形或月牙形 细胞易胀破而发生溶血 血红蛋白含量低红细胞数目减少 患者头昏 胸闷等 总结 蛋白质的一级结构决定它的空间结构 而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证 前体蛋白质无活性 需经过加工修饰才具有生物活性 同一功能的蛋白质其氨基酸的排列顺序具有种属差异 但与功能密切相关的氨基酸残基高度保守的 不同种属间同一功能的蛋白质一级结构上相对应的氨基酸差别越大 其亲缘关系愈远 反之 其亲缘关系愈近 由于基因结构改变 蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变 从而导致蛋白质功能障碍 二 蛋白质的空间结构与功能的关系以血红蛋白 Hb 为例加以说明 Hb的结构如图所示 Hb由4条肽链组成 2 2 功能是运载O2 在去氧Hb亚基中有下列几对离子键 血红蛋白 Hb 的空间结构是由四个亚基组成 包括两个 亚基和两个 亚基 每个亚基上有一个血红素和与氧结合的部位 Hb通过与氧的结合与分离实现对氧的运输 Hb属于别构蛋白 有去氧血红蛋白 T态或紧张态 和氧和血红蛋白 R态或松弛态 两种互换构象 氧和两种构象的血红蛋白均能结合 但对R态血红蛋白的亲和力明显高于T态血红蛋白 原因 去氧血红蛋白亚基之间存在大量离子键 对血红蛋白起着稳定作用 四个亚基末端处于受束缚状态 使构象呈紧张态 当O2与第一个亚基结合时 离子键的破坏较难 所需要的能量较多 因此 T态对氧的亲和力很低 但当血红蛋白的一个亚基与氧结合之后引起该亚基的构象变化 相应引起其它亚基构象变化 次级键重组 整个分子构象从紧张态变成松弛态 R态 使亚基血红素铁原子的位置都变得易于与氧结合 使血红蛋白对氧的亲和力大大增强 正协同效应 Hb与O2结合后 Hb的构象发生变化 这类变化称为变构效应 即通过构象变化影响蛋白质的功能 像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白 allostericprotein 血红蛋白通过变构效应在氧分压较高的肺部高效率的与氧结合 在氧分压较低的肝 肌肉等组织释放氧 这种变构效应能更有效地行使血红蛋白运氧的生物学功能 变构效应 血红蛋白的别构效应一个亚基与氧结合后 引起该亚基构象改变进而引起另三个亚基的构象改变整个分子构象改变与氧的结合能力增加 结论 各种蛋白质都有特定的空间构象 而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应 蛋白质的结构与功能是高度统一的 结课 复习 1 请回答何谓蛋白质的三级结构和四级结构 2 请根据你的理解和掌握说明蛋白质与功能的关系主要表现在哪些方面 3 根据上节课的学习请分析血红蛋白运输氧的作用机理 三级结构是指一条多肽链中所有原子的整体空间排布 是包括主 侧链在内的特征性构象 两个或两个以上具有独立的三级结构的多肽链 亚基 彼此借次级键相连 形成一定的空间结构 称为四级结构 蛋白质的一级结构决定它的空间结构 而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证 前体蛋白质无活性 需经过加工修饰才具有生物活性 种属差异 分子病蛋白质空间结构与功能的关系 一 蛋白质分子的相对分子质量蛋白质的相对分子质量很大 其变化范围在一万到一百万或更大一些 测定方法 1 根据化学组成测定最低相对分子质量2 渗透压法 3 凝胶过滤法4 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 5 超速离心法 利用超速离心机测定蛋白质相对分子质量的方法 测得的相对分子质量最准确 常用的方法有两种 1 沉降速度法 2 沉降平衡法 第六节蛋白质的理化性质 二 蛋白质的两性电离和等电点 一 两性解离和等电点的含义 蛋白质的解离方程 表 几种蛋白质的等电点 二 应用 蛋白质的分离提纯 根据 1 蛋白质在等电点时以两性离子的形式存在 其总净电荷为零 这样的蛋白质颗粒在溶液中因为没有相同电荷而相互排斥的影响 极易借静电引力迅速结合成较大的集聚体而沉淀析出 2 蛋白质是两性电解质 可用电泳方法分离蛋白质混合物 如 人血清蛋白的分离 电泳 蛋白质与多肽一样 能够发生两性离解 也有等电点 在等电点时 IsoelectricpointpI 蛋白质的溶解度最小 在电场中不移动 在不同的pH环境下 蛋白质的电学性质不同 在外液pH低于等电点的溶液中 蛋白质粒子带正电荷 在电场中向负极移动 在外液pH高于等电点的溶液中 蛋白质粒子带负电荷 在电场中向正极移动 这种现象称为蛋白质电泳带电粒子在电场中移动的现象 1 自由界面电泳 蛋白质溶于缓冲液中进行电泳 2 区带电泳 将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳 不同组分形成带状区域 1 纸上电泳 用滤纸作支持物 2 凝胶电泳 用凝胶 淀粉 琼脂糖 聚丙烯酰胺 作支持物 1 圆盘电泳 玻璃管中进行的凝胶电泳 2 平板电泳 铺有凝胶的玻板上进行的电泳 近年来常用醋酸纤维薄膜做支持物电泳分离血清蛋白 表 我国正常成人血清蛋白质组成 人血清蛋白它们的等电点不同 在PH8 6缓冲液中都以阴离子形式存在 通过后都向阳极移动 由于它们所带电荷数目和相对分子质量不同 在电场中泳动的速度不同 通电一定时间后 几种蛋白质则分开 三 蛋白质的胶体性质 一 亲水胶体的特征 二 蛋白质胶体性质的应用 三 蛋白质溶液是比较稳定的亲水胶体 一 亲水胶体的特征 2 丁道尔现象 光学性质 3 电泳 电学性质 4 具有吸附能力 5 不能透过半透膜 1 布朗运动 动力学性质 胶体 是一种分散体系中的组分 在这种体系中某一组分通过另一组分而被分散 例如粘土 一种组分 被水分散 蛋白质分子溶于水中是以单分子分散 附页 布朗运动 蛋白质分子不断地作不规则的 之 字形运动 吸附能力 固体表面和液体表面的分子具有未完全饱和的价键力 因此这些表面可以从接触相中吸着其它分子 丁道尔现象 一束强的光穿过蛋白质溶液时 从光束的侧面可以看到有蛋白质颗粒散射而发出的一个光锥 电泳 在外加电场的作用下 蛋白质颗粒在分散介质中的移动 二 蛋白质胶体性质的应用 分离蛋白质 利用透析法将大分子蛋白质与小分子进行分离 透析法 以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜 只允许溶剂小分子通过 而溶质大分子不能通过 如羊皮纸 火棉胶 玻璃纸等 三 蛋白质溶液是比较稳定的亲水胶体 1 蛋白质分子 分散相的质点 的大小在1 100nm范围内 这样大小的质点在动力学上是最稳定的 2 水化膜 蛋白质分子表面具有极性的亲水基团吸附水分子而在分子表面形成一层水膜 水化膜使蛋白质颗粒相互隔开 颗粒间不会因碰撞而聚成大颗粒 3 带电荷 蛋白质分子在酸性或碱性溶液中 带有相同的电荷 使蛋白质分子之间相互排斥 使其保持一定的距离 加强了亲水胶体的稳定性 四 蛋白质沉淀作用 一 蛋白质沉淀及沉淀原理当蛋白质的水化膜被破坏 蛋白质所带电荷被中和时 蛋白质则发生凝集并使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀 蛋白质沉淀原理 二 沉淀方法 引起蛋白质沉淀的条件 盐析 在蛋白质的水溶液中 加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺 氯化钠 硫酸钠等 使蛋白质脱去水化膜而从溶液中聚集析出 称为蛋白质的盐析 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中 会导致蛋白质的溶解度增加 该现象称为盐溶 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法 该方法不会使蛋白质产生变性 当除去盐后 还可溶解 属可逆沉淀 附页 有机溶剂沉淀法 在蛋白质溶液中 加入能与水互溶的有机溶剂如甲醇 乙醇 丙酮等 蛋白质产生沉淀 有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行 否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性 长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品 以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害 附页 4 生物碱试剂沉淀法 条件 pH稍小于pI 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质 能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂 生物碱试剂一般为弱酸性物质 如单宁酸 苦味酸 三氯乙酸等 在酸性条件下 蛋白质带正电 可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀 5 弱酸或弱碱沉淀法 破坏蛋白质表面净电荷 6 加热沉淀变性法 蛋白质天然结构解体 疏水基外露 因而破坏了水化膜 使大多数蛋白质变性沉淀 如奶品中的蛋白质加热后虽变性但不沉淀 五 蛋白质的变性作用 一 蛋白质变性的概念 天然蛋白质受物理或化学因素作用后 使其维系蛋白质空间结构的氢键等次级键受到破坏 引起蛋白质空间结构发生改变 一级结构不变 其组成成分和相对分子质量不变 使其失去原有的生物活性 并伴随着物理化学性质的改变 这种作用称为蛋白质的变性 天然状态下有催化活性的核糖核酸酶 非折叠状态无催化活性的核糖核酸酶 核糖核酸酶在8mol L尿素存在下 用 硫基乙醇处理后 分子内部的4个二硫键则被断裂 紧密的球状结构伸展成松散的无规则卷曲构象 当用透析法将尿素和 硫基乙醇除去后 RNA酶又恢复活性 附页 二 引起蛋白质变性的因素 1 物理因素 高温 高压 射线等2 化学因素 强酸 强碱 尿素 胍 去污剂 重金属盐 三氯醋酸 磷钨酸 苦味酸 浓乙醇等 三 蛋白质变性后的表现 1 生物学活性消失 为变性的主要特征 2 侧链反应增强3 一些理化性质改变 1 溶解度下降 2 粘度增加 扩散系数降低 旋光和紫外吸收增加4 生物化学性质改变 对酶的作用敏感 易被水解 1 生物活性丧失是指蛋白质所具有的酶 激素 毒素 抗原与抗体等活性 以及其他特殊性质如血红蛋白的载氧能力 肌球蛋白与肌动蛋白相互作用时的收缩能力等 2溶解度降低空间结构破坏后 分子表面结构发生很大变化 原来藏在分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面 亲水基团相对减少 使蛋白质颗粒失去水化膜 溶解度降低 一般在等电点区域不溶解 很容易相互碰撞发生聚集而沉淀 但在碱性溶液中或有尿素 盐酸胍等变性剂存在时 则仍保持溶解状态 透析除去这些变性剂后 又可沉淀析出 3球状蛋白质变性后 分子形状也发生改变 蛋白质分子伸展 不对称程度增高 反映在粘度增加 扩散系数降低 旋光和紫外吸收的变化 4 生物化学性质的改变 蛋白质变性后 分子结构伸展松散 易被蛋白酶分解 变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白水解酶作用 这就是熟食易于消化的道理 附页 蛋白质变性与蛋白质沉淀的区别 变性是蛋白质空间结构的改变 沉淀是溶液中析出固体物质的现象 变性的本质 蛋白质分子中的次级键被破坏 引起空间结构的破坏 1 沉淀 不稳定蛋白质从溶液中析出 2 结絮 变性蛋白质的絮状沉淀 沉淀可溶于强酸 强碱 3 凝固 沉淀结块 凝块不溶于强酸 强碱 蛋白质产生沉淀不一定变性 变性不一定凝固 但凝固一定是变性 六蛋白质的颜色反应 OH N 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸 这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收 因此 大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收 利用这个性质 可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定 七 蛋白质的紫外吸收 结课 复习 1 请根据上节课的学习 回忆一下蛋白质都有哪些重要的理化性质 2 在混合的蛋白质溶液中 已知有酪蛋白存在 请根据你所掌握的知识将混合液中的酪蛋白分离出来 3 为什么说蛋白质是比较稳定的亲水胶体 第七节 蛋白质的分类 球形或椭圆形 溶解性较好 能形成结晶 大多数蛋白质属于这一类 分子类似纤维或细棒 依组成分 简单蛋白 结合蛋白 又称单纯蛋白质 这类蛋白质只由氨基酸组成的肽