第七章气相色谱分析分析.ppt

生物工业分析 第七章气相色谱法 教学目的与要求 掌握气相色谱分析的原理 熟悉气相色谱分析的操作方法和操作条件 教学重点与难点 理解掌握气相色谱分析的原理和操作技术 教学方法 课堂讲授与自学相结合 教学内容 气相色谱分析 7 1概述7 1 1气相色谱分离的原理及流程 1 原理 流动相为惰性气体 气 固色谱法中常以表面积大且具有一定活性的吸附剂为固定相 当多组分的混合物样品进入色谱柱后 由于吸附剂对每个组分的吸附力不同 故各组分在色谱柱中停留的时间也不同 气 液色谱中 以均匀地涂渍在载体表面的液膜为固定相 当样品被载气带入柱中到达固定相表面时 就会溶解在固定相中 由于各组分在固定相中的溶解度不同 故各组分在柱中的运行速度也不同 即实现各组分在色谱柱中彼此分离 随之顺序进入检测器中被检测 记录下来 气相色谱分析 2 气相色谱的一般流程 图7 1 3 气相色谱仪组成由五大系统组成 气路系统 进样系统 分离系统 温控系统和检测记录系统 7 1 2气相色谱法的特点分离效率高灵敏度高选择性好分析速率快应用范围广 7 1 3基本概念1 色谱流出曲线 以组分的浓度变化作为纵坐标 流出时间作横坐标的 这种曲线称为色谱流出曲线 图7 2 气相色谱分析 2 基线 baseline 在操作条件下 没有组分流出时的流出曲线称为基线 稳定的基线应是一条平行于横轴的直线 主要反应检测器的噪声随时间变化的情况 基线漂移 baselinedrift 指基线随时间定向的缓慢变化 3 基线噪声 baselinenoise 指由各种因素所引起的基线起伏 4 保留值 retentionvalue 表示试样中各组分在色谱柱中的滞留时间的数值 通常用时间或用将组分带出色谱柱所需载气的体积来表示 气相色谱分析 5 保留时间 retentiontime tR 指被测组分从进样开始到出现色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间 6 死时间 deadtime t0指分配系数为零的组分 如空气 甲烷 的保留时间称为死时间 7 调整保留时间 adjustedretentiontime tR 指某组分由于溶解或吸附于固定相 比不溶解或不被吸附的组分在色谱柱中多滞留的时间 tR tR t0 气相色谱分析 8 死体积 deadvolume V0指色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 当后两项很小而可忽略不计时 死体积可由死时间与色谱柱出口的载气体积流速F0来计算V0 t0F09 保留体积 retentionvolme VR指从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时所通过色谱柱的载气体积 即VR tRF010 调整保留体积 adjustedretentionvolme VR 指扣除死体积后的保留体积 即VR tR FO或VR VR V0 气相色谱分析 11 区域宽度 peakwidth 区域宽度越窄越好 度量色谱峰区域宽度的三种方法 1 标准偏差 standarddeviation 为正态分布曲线上两拐点间距离的一半 对于正常的峰 即0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半 2 半峰宽度 Peakwidthathalfheight Yl 2或Wl 2又称半宽度或区域宽度 即峰高为一半处的宽度 它与标准偏差的关系为 3 峰底宽度 PeakwidthatPeakbase Y或W自色谱峰两侧的拐点所作切线在基线上的截距 它与标准偏差的关系为Y 4 气相色谱分析 12 分配系数 物质在固定相和流动相 气相 之间发生的吸附 脱附和溶解 挥发的过程 叫做分配过程 在一定温度下组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比称为分配系数K 13 分配比 分配比亦称容量因子或容量比 以k表示 是指在一定温度 压力下 在两相间达到分配平衡时 组分在两相中的质量比 式中ms为组分分配在固定相中的质量 mM为组分分配在流动相中的质量 气相色谱分析 分配比k与分配系数K的关系为 式中VM为色谱柱中流动相体积 即柱内固定相颗粒间的空隙体积 VS为色谱柱中固定相体积 在气 液色谱分析中它为固定液体积 在气 固色谱分析中则为吸附剂表面容量 VM与VS之比称为相比 以 表示之 由上式可见 1 分配系数是组分在两相中浓度之比 分配比则是组分在两相中分配总量之比 它们都与组分及固定相的热力学性质有关 并随柱温 柱压的变化而变化 气相色谱分析 2 分配系数只决定于组分和两相性质 与两相体积无关 分配比不仅决定于组分和两相性质 且与相比有关 亦即组分的分配比随固定相的量而改变 3 对于一给定色谱体系 分配体系 组分的分离最终决定于组分在每相中的相对量 而不是相对浓度 因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数 k值越大 保留时间越长 k值为零的组分 其保留时间即为死时间t0 4 若流动相 载气 在柱内的线速度为u 即一定时间里载气在柱中流动的距离 单位为cm s 1 由于固定相对组分有保留作用 所以组分在柱内的线速度uS将小于u 则两速度之比称为滞留因子Rs 气相色谱分析 利用色谱流出曲线可以解决以下问题 1 根据色谱峰的位置 保留值 可以进行定性鉴定 2 根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量测定 3 根据色谱峰的位置及其宽度 可以对色谱柱分离情况进行评价 气相色谱分析 7 2气相色谱操作7 2 1操作条件的选择1 分离条件的选择分离度 resolution 定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值 式中tR 2 和tR 1 分别为两组分的保留时间 也可采用调整保留时间 Y1和Y2为相应组分的色谱峰的峰底宽度 与保留值单位相同 R值越大 就意味着相邻两组分分离得越好 若峰形对称且满足于正态分布 则当R 1时 分离程度可达98 当R 1 5时 分离程度可达99 7 因而可用R 1 5来作为相邻两峰已完全分开的标志 气相色谱分析 当两组分的色谱峰分离较差 峰底宽度难于测量时 可用半峰宽代替峰底宽度 并用下式表示分离度 与R的物理意义是一致的 R 0 59R 应用时要注意所采用分离度的计算方法 对于难分离物质对 由于它们的保留值差别小 可合理地认为Y1 Y2 Y k1 k2 k 经整理推导得用有效理论塔板数表示的色谱分离基本方程式为 式中 是柱选择性的量度 n有效为有效理论塔板数 气相色谱分析 1 分离度与柱效的关系 柱效因子 当固定相确定 亦即被分离物质对的 柱选择性的量度 确定后 欲使达到一定的分离度 将取决于n 有效理论塔板数 增加柱长可改进分离度 但增加柱长使各组分的保留时间增长 延长了分析时间并使峰产生扩展 因此在达到一定的分离度条件下应使用短一些的色谱柱 除增加柱长外 增加n值的另一办法是减小柱的塔板高度 H 这意味着应制备一根性能优良的柱子 并在最优化条件下进行操作 气相色谱分析 2 分离度与容量比的关系 容量因子 k值大一些对分离有利 但并非越大越有利 当是k 10时 k k 1 的改变不大 对R的改进不明显 反而使分析时间大为延长 因此k值的最佳范围是1 k 10 在此范围内 既可得到大的R值 亦可使分析时间不至过长 使峰的扩展不会太严重而对检测发生影响 使k改变的方法有 改变柱温和改变相比 前者会影响分配系数而使k改变 改变相比包括改变固定相量VS及柱的死体积V0 其中V0影响k 1十k 当组分的保留值较大而V0又相当小时 k 1十k 随V0增加而急剧下降 导致达到相同的分离度所需n值大为增加 由此可见 使用死体积大的柱子 分离度要受到大的损失 采用细颗粒固定相 填充得紧密而均匀 可使柱死体积降低 气相色谱分析 3 分离度与柱选择性的关系 选择因子 是柱选择性的量度 越大 柱选择性越好 分离效果越好 在实际工作中 可由一定的 值和所要求的分离度 计算柱子所需的有效理论塔板数 表7 1列出了根据公式计算得到的一些结果 当 值为1时 分离所需的有效理论塔板数为无穷大 故分离不能实现 在 值相当小的情况下 特别是 1 1时 实现分离所需的有效理论塔板数很大 此时首要的任务应当是增大当 值 如果两相邻峰的 值已足够大 即使色谱柱的理论塔板数较小 分离亦可顺利地实现 增加 简便而有效的方法是通过改变固定相 使各组分的分配系数有较大差别 气相色谱分析 表7 1在给定的 值下 获得所需分离度对柱有效理论塔板数的要求 气相色谱分析 分离度 柱效和选择性参数的联系 因而只要已知两个指标 就可估算出第三个指标 气相色谱分析 2 操作条件的选择 1 载气及其流速的选择塔板高度H与其线速度u的关系为H A十 B u 十Cu式中A B C为三个常数 其中A称涡流扩散项 B为分子扩散项 C为传质阻力 用在不同流速下测得的塔板高度H对流速u作图 得H u曲线图 图7 5 在曲线的最低点 塔板高度H最小 H最小 此时柱效最高 该点所对应的流速即为最佳流速u最佳 u最佳及H最小可由上式微分求得 得出 气相色谱分析 在实际工作中 为了缩短分析时间 往往使流速稍高于最佳流速 从图7 5可见 当流速较小时 分子扩散项 B项 就成为色谱峰扩张的主要因素 此时应采用相对分子质量较大的载气 N2 Ar 使组分在载气中有较小的扩散系数 而当流速较大时 传质项 C项 为控制因素 宜采用相对分子质量较小的载气 H2 He 此时组分在载气中有较大的扩散系数 可减小气相传质阻力 提高柱效 图7 3 气相色谱分析 2 柱温的选择选择的原则是 在使最难分离的组分能尽可能好的分离的前提下 尽可能采取较低的柱温 但以保留时间适宜 峰形不拖尾为度 对于高沸点混合物 300 400 希望在较低的柱温下 低于其沸点100 200 分析 可用低固定液含量 质量分数1 3 对于沸点不太高的混合物 200 300 可在中等柱温下操作 固定液质量分数5 10 柱温比其平均沸点低100 对于沸点在100 200 的混合物 柱温可选在其平均沸点2 3左右 固定液质量分数10 15 对于气体 气态烃等低沸点混合物 柱温选在其沸点或沸点以上 以便能在室温或50 以下分析 固定液质量分数一般在15 25 对于沸点范围较宽的试样 宜采用程序升温 即柱温按预定的加热速度 随时间作线性或非线性的增加 图7 4为宽沸程试样在恒定柱温及程序升温时的分离结果比较 图 a 为柱温 TC 恒定于45 时的分离结果 此时只有五个组分流出色谱柱 但低沸点组分分离良好 图 b 为柱温恒定于120 时的分离情况 因柱温升高 保留时间缩短 低沸点组分峰密集 分离不好 图 C 为程序升温时的分离情况 从30 起始 升温速度为5 min 1 低沸点及高沸点组分都能在各自适宜的温度下得到良好的分离 图7 4 气相色谱分析 3 固定相的选择气 固色谱固定相在气 固色谱法中作为固定相的吸附剂 非极性的活性炭 弱极性的氧化铝 强极性的硅胶 和聚合物固定相 高分子多孔微球和键合固定相 气 液色谱固定相担体又称载体 对担体有以下几点要求 表面应是化学情性的 即表面没有吸附性或吸附性很弱 更不能与被测物质起化学反应 多孔性 即表面积较大 使固定液与试样的接触面较大 气相色谱分析 热稳定性好 有一定的机械强度 不易破碎 对担体粒度的要求 一般希望均匀 细小 这样有利于提高柱效 但颗粒过细 使柱压降增大 对操作不利 一般选用40 60目 60 80目或80 100目等 选择担体的大致原则为 当固定液质量分数大于5 时 可选用硅藻土型 白色或红色 担体 当固定液质量分数小于5 时 应选用处理过的担体 对于高沸点组分 可选用玻璃微球担体 对于强腐蚀性组分 可选用氟担体 气相色谱分析 固定液 对固定液的要求 a 挥发性小 在操作温度下有较低蒸气压 以免流失 b 热稳定性好 在操作温度下不发生分解 在操作温度下呈液体状态 c 对试样各组分有适当的溶解能力 否则易被载气带走而起不到分配作用 d 具有高的选择性 即对沸点相同或相近的不同物质有尽可能高的分离能力 e 化学稳定性好 不与被测物质起化学反应 f 粘度低 凝固点低 以便在载体表面能均匀分布 气相色谱分析 固定液的分离特征 固定液的选择 一般根据 相似相溶 原理进行 如果组分与固定液分子性质 极性 相似 固定液和被测组分两种分子间的作用力就强 被测组分在固定液中的溶解度就大 分配系数就大 也就是说 被测组分在固定液中溶解度或分配系数的大小与被测组分和固定液两种分子之间相互作用力的大小有关 分子间的相互作用力包括静电力 诱导力 色散力和氢键力等 气相色谱分析 固定液的选择a 分离非极性物质 一般选用非极性固定液 这时试样中各组分按沸点次序先后流出色谱柱 沸点低的先出峰 沸点高的后出峰 b 分离极性物质 选用极性固定液 这时试样中各组分主要按极性顺序分离 极性小的先流出色谱柱 极性大的后流出色谱柱 c 分离非极性和极性混合物时 一般选用极性固定液 这时非极性组分先出峰 极性组分 或易被极化的组分 后出峰 d 对于能形成氢键的试样一般选择极性的或是氢键型的固定液 不易形成氢键的先流出 最易形成氢键的最后流出 e 对于复杂的难分离物质 则可选用两种或两种以上的混合固定液 f 样品极性未知时 一般先用最常用的几种固定液做实验 根据色谱分离的情况 选择合适极性的固定液 在实际应用中 一般依据经验规律或参考文献 按最接近的性质来选择 气相色谱分析 4 进样时间和进样量进样速度必须很快 一般用注射器或进样阀进样时 进样时间都在一秒钟以内 液体试样一般进样0 1 5 L 气体试样0 1 10mL 最大允许的进样量 应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内 5 气化温度进样后要有足够的气化温度 使液体试样迅速气化后被载气带入柱中 在保证试样不分解的情况下 适当提高气化温度对分离及定量有利 一般选择气化温度比柱温高30 70 6 检测器检测器的主要性能指标a灵敏度 S 单位浓度 或质量 的组分通过检测器时产生的信号大小 称为该检测器对该组分的灵敏度 用S表示 b检出限又称敏感度 指当检测器恰能产生和噪声相鉴别的信号时 在单位体积与单位时间内通过检测器的组分的质量 或浓度 用D表示 c最小检测量指检测器恰能产生3倍于噪声的信号时所需进入色谱柱的最小物质量 或最小浓度 用Q0表示 d线性范围指检测器信号大小与被测组分的量成线性关系的范围 通常用线性范围内的最大进样量和最小进样量之比来表示 e响应时间指进入检测器的某一组分的输出信号达到其值的63 时所需的时间 一般小于1s 一个性能优良的检测器应该具有 灵敏度高 检出限低 死体积小 响应迅速 线性范围宽和稳定性好的特点 气相色谱分析 7 2 2操作步骤启动仪器前先检查气路 电路是否按照要求接好 通入载气 先开钢瓶阀 再开减压器 调节针形阀 控制载气流速度使之符合操作条件 启动 恒温 开启总电源开关 再依次打开柱槽 进样器 热导温控开关 将柱温 汽化室 检测器温度调节旋钮转至要求的位置 加热至一定时间后 用温度测量旋钮分别检查三处温度是否符合要求 若温度已符合要求 再检查载气流速是否正常 气相色谱分析 调整基线衰减到要求值 打开热导开关 将桥电流调节旋钮旋到电流要求值 同时打开数据处理系统 击 查看基线 再击 基线调零 此时 基线回到 0 位置 仪器稳定后 基线应在 0 位置 若不在 击 基线调零 选择适当的时间值电压值和分析方法及其他选项 待基线走直后 即可进行分析 进样 用微量进样器注入待测样品 关机 测量完成后 将桥电流调节旋钮转到最小位置 关闭热导电源 柱槽 进样器 热导温控开关 再关掉总电源 待温度下降后 关断载气 气相色谱分析 7 3色谱分析7 3 1定性分析方法1 用已知纯物质对照定性用已知纯物质对照定性是最方便可靠的方法 可采用保留值法 相对保留值法 加入已知物质增加峰高和双柱 多柱定性的方法 气相色谱分析 2 用经验规律和文献值进行定性分析3 与其它方法结合的定性分析法 1 与质谱 红外光谱等仪器联用较复杂的混合物经色谱柱分离为单组分 再利用质谱 红外光谱或核磁共振等仪器进行定性鉴定 2 与化学方法配合进行定性分析带有某些官能团的化合物 经一些特殊试剂处理 发生物理变化或化学反应后 其色谱峰将会消失或提前或移后 比较处理前后色谱图的差异 就可初步辨认试样含有哪些官能团 气相色谱分析 7 3 2定量分析方法定量分析的依据是 在一定操作条件下 待测组分i的质量 mi 或其在载气中的浓度是与检测器的响应信号 峰面积Ai或峰高hi 成正比的 可写作 mi fi Ai或mi fi hi式中fi fi 分别为峰面积和峰高定量校正因子 1峰面积测量法 1 峰高乘半峰宽法当色谱峰为对称峰时可采用此法 根据等腰三角形面积的计算方法 可以近似认为峰面积等于峰高乘以半峰宽 这样测得的峰面积为实际峰面积的0 94倍 实际上峰面积应为 气相色谱分析 2 峰高乘底宽度法这是一种作图求峰面积的方法 这种作图法测得的峰面积约为真实面积的0 98倍 对于矮而宽的峰 此法更准确些 但应注意 在同一分析中 只能用同一种近似测量方法 3 峰高乘平均半峰宽法对于不对称色谱峰 峰形很窄或交叠在半峰宽以上的峰 使用此法可得较准确的结果 所谓平均峰宽是指在峰高0 15和0 85处分别测峰宽 然后取其平均值 气相色谱分析 4 峰高乘保留值法在一定操作条件下 同系物的半峰宽与保留时间成正比 即 在相对计算时 b可约去 于是 此法适用于狭窄的峰 气相色谱分析 5 积分仪积分仪或称数据处理机是测量峰面积最方便的工具 速度快 线性范围宽 精度一般可达0 2 2 对小峰或不对称峰也能得出较准确的结果 数字电子积分仪能以数字的形式把峰面积和保留时间打印出来 2定量校正因子 绝对定量校正因子fi 即单位峰面积所相当的组分量 fi mi Ai式中mi为组分i的量 它可以是质量 物质的量或体积 对气体 相对定量校正因子fi 样品中各组分的绝对定量校正因子与标准的绝对定量校正因子之比 fi fi fs miAs msAi式中 m和A分别为质量和面积 下角i和s分别代表待测组分和标准物 相对校正因子的测量测定方法 准确称量纯被测组分和标准物质 混合均匀后 在实验条件下进样分析 分别测量相应的峰面积 然后通过公式计算相对校正因子 一般地 热导池检测器标准物用苯 火焰离子检测器标准物用正庚烷 注意进样量应在线性范围内 气相色谱分析 3定量计算方法 1 归一化法当试样中各组分都能流出色谱柱 并在色谱图上显示色谱峰时 可用此法进行定量计算 假设试样中有n个组分 每个组分的质量分别为m1 m2 mn 各组分含量的总和m为100 其中组分i的质量分数 可按下式计算 f