补体结合试验.doc

第二节 补体结合试验补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。一、类型及原理自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成 膜攻击复合物（membrane attack complex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；补体系统；指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。图14-2补体结合试验示意图二、试验方法补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。（一）试剂1抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用24个单位（1:641:32），抗体采用4个单位（1:8）。表14-4抗原和抗体的方阵滴定抗原抗血清稀释倍数抗原对照1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:44444443201:84444432101:16444432201:32444431001:6444420001:1284210000001:2563100000001:512000000000抗体对照00000000注：1、2、3、4分别表示溶血反应强度、；0为不溶血。3补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.122:600.2:x计算，x50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。表14-5补体的滴定管号1:60补体（ml）缓冲液（ml）稀释抗原（ml）致敏srbc（ml）结果10.040.260.1放置37水浴30min0.2放置37水浴30min不溶血20.060.240.10.2不溶血30.080.220.10.2微溶血40.100.200.10.2微溶血50.120.180.10.2全溶血60.140.160.10.2全溶血（二）血清标本采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于20。血清在试验前应先加热5630min（或603min）以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：加热提高12；20冻融后离心去沉淀；以3mmol/l盐酸处理；加入少量补体后再加热灭活；以白陶土处理；通入co2；以小白鼠肝粉处理；用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。（三）正式试验以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2u为全溶，1u为全溶略带有少许红细胞，0.5u应不溶。如0.5u补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2u对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序反应物（ml）待检血清管阳性对照管阴性对照管抗原对照管补体对照管红细胞对照管测定对照测定对照测定对照2u1u0.5u稀释血清0.10.10.10.10.10.1抗原0.10.10.10.10.10.10.1缓冲液0.10.10.10.10.10.10.10.42u补体0.20.20.20.20.20.20.20.21u补体0.20.5u补体0.2混匀，置371h或41618h致敏红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2混匀，置3730min后观察结果三、应用和评价补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05g/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。补体结合试验可应用在以下几方面：传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。