雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤血管生成作用的研究.doc

雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤血管生成作用的研究姜华1，孙成法1，褚荣涛1，王君祥1，周幽心2，谢学顺2（1 常熟市第二人民医院神经外科 215500；2苏州大学附属第一医院神经外科 215006）关键词 雷公藤红素；胶质瘤；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体1；血管内皮生长因子受体2 摘要 目的：探讨雷公藤红素对荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长及血管生成的作用机制。方法: 建立BALB/c裸小鼠SHG-44胶质瘤同种移植动物模型，将34只荷瘤裸鼠随机分为5组,采用腹腔内注射给药方法。雷公藤红素按三种浓度4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg分组给药；阳性对照顺铂组按2mg/kg给药。每周两次，共给药四周。定期观察肿瘤生长情况测量肿瘤体积，计算抑瘤率。免疫组化染色检测移植瘤组织中的MVD、bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达。结果: 与空白对照组相比，雷公藤红素4mg/kg组、雷公藤红素2mg/kg组均能抑制肿瘤生长(P 0.05)，其体积抑瘤率分别为35%、26.9%。VEGF蛋白表达在移植瘤组织中均可检测到,各组间无显著性差异。空白对照组中bFGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达高且微血管计数(MVD)最多；雷公藤红素4mg/kg组下调荷瘤裸鼠移植瘤组织中bFGF的蛋白表达。雷公藤红素4mg/kg、2mg/kg组均能下调移植瘤组织中VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达(0.05)，微血管计数(MVD)也随之降低(0.05)，呈剂量依赖关系。结论: 雷公藤红素能明显抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤生长，并存在剂量依赖性。雷公藤红素对bFGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达有显著下调作用，对VEGF蛋白表达没有影响。雷公藤红素抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长的机制可能是：下调肿瘤组织中VEGFR蛋白表达，阻止VEGF发挥效应，抑制肿瘤血管生成；下调bFGF的蛋白表达，对抑制肿瘤血管生成有一定作用。Antiangiogenic activity of Celastrol inhibits SHG44 glioma growthJIANG Hua1,SUN Cheng-Fa1,CHU Rong-Tao1,WANG Jun-Xiang1,ZHOU You-Xin2,XIE Xue-Shun2 1Department of Neurosurgery,The SecondHospital of Changshu,Changshu 215500; 2Department of Neurosurgery,Affiliated First Hospital,Soochow University,Suzhou 215006,China)Key word celastrol; glioma; basic fibroblast growth factor；vascular endothelial growth factor; vascular endothelial growth factor 1; vascular endothelial growth factor 2ABSTRACT Aim: To investigate the effects and explore the mechanism of Celastrol on the angiogenesis and growth of SHG44 glioma cells in vivo.Methods: Animal models were established, in which 34 BALB/c nude mice were transplanted subcutaneously SHG44 glioma cells. The total mice were divided into five groups randomly, including the control group treated without drugs, a group with Cisplatin (2 mg/kg, ip five times weekly for four weeks), and three groups with different doses of Celastrol (4mg/kg, 2mg/kg and 1mg/kg, ip five times weekly for four weeks). The dimensions of xenografts were measured and the living states of the mice observed. The expressions of microvessel density (MVD), basic fibroblast growth factor(bFGF) vascular endothelial growth factor(VEGF), vascular endothelial growth factor 1(VEGFR1), and vascular endothelial growth factor 2(VEGFR2) were detected in each paraffin imbedded xenograft of the mice by immunohistochemistry staining. Result: Compared with the control group, both two Celastrol-treated groups (4 mg/kg and 2 mg/kg) inhibited the growth of xenografts in nude mice (p0.05) among five groups in the protein expression level of VEGF. In addition, the control group showed a high level in of protein expression both VEGFR1、VEGFR2 and bFGF , along with the larger increase in MVD. While the two Celastrol-treated groups (4 mg/kg and 2 mg/kg) showed lower levels of protein expression (p0.05) and deceases in MVD (p 80 %。7统计学处理：计量数据采用均数标准差(s)表示，采用SPSS13软件作单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较运用LSD-t检验。检验以P 0.05表示有统计学差异。结果1荷SHG-44胶质瘤裸鼠的一般生长情况：各组荷瘤裸鼠生长状况良好，体重呈增加趋势；移植瘤体积也呈增大趋势，但生长速率不同。未观察到明显的毒副作用,如活动迟缓、腹泻、厌食等症状。移植瘤瘤体呈球形或不规则团块状，边界尚清，有活动度，质地韧，可渐侵润皮肤、肌肉、甚至骨骼，部分瘤体皮肤有坏死，见图1。2雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的抑制作用：各组荷SHG-44胶质瘤裸鼠的移植瘤测量体积见表1。自异体瘤块移植后荷瘤裸鼠生长15天，各组皮下移植瘤平均体积已增长至0.16cm3 ，开始给药；给药第1天和第6天，统计学分析五组移植瘤生长体积差异无统计学意义(F =0.685 P =0.608)。自给药第11天开始，空白对照组和雷公藤红素1mg/kg组肿瘤生长速率开始加快，各组移植瘤生长体积相比较均有显著性差异(F =5.501，P =0.002)。雷公藤红素4mg/kg组、雷公藤红素2mg/kg组、雷公藤红素1mg/kg组、阳性对照顺铂组的体积抑瘤率分别为35%、26.9%、12.8%、41.4%；与空白对照组相比， 雷公藤红素4mg/kg组、阳性对照顺铂组的肿瘤生长体积比较差异显著（P 0.01）；雷公藤红素2mg/kg组与空白对照组相比较有差异（P 0.05），并存在剂量依赖性。3.雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤微血管密度（MVD）的影响见图2。不同剂量的雷公藤红素对荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度(MVD)均有影响4. 雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达的IRS见表2。五组荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1的免疫反应分数组间比较(LSD法)发现：雷公藤红素4mg/kg、2mg/kg与1mg/kg组间比较无差异；VEGFR2组间比较发现：雷公藤红素4mg/kg组与雷公藤红素1mg/kg组比较差异显著；bFGF组间比较发现：雷公藤红素4mg/kg组与2mg/kg组、1mg/kg组比较差异显著。结果提示不同剂量的雷公腾红素对荷瘤裸鼠移植瘤的VEGF蛋白表达没有影响；雷公藤红素不同剂量组均能下调荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1蛋白表达，但还不能认为三者之间有差别；雷公藤红素4mg/kg组和雷公藤红素2mg/kg组均能下调荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR2蛋白表达，且存在剂量依赖性。雷公藤红素4mg/kg组和阳性对照顺铂组均能下调bFGF的蛋白表达。讨论肿瘤的主要生物学行为特征是无限增殖,其无限增殖的前提是要有新生血管提供营养物质,新生血管是实体肿瘤生长的必备条件7。肿瘤血管生成不足可致使肿瘤细胞程序性死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。MVD是表示肿瘤血管生成数量的有效指标, 胶质瘤的微血管密度及形态结构与其预后及生物学行为密切相关。本研究发现，顺铂组对荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度没有影响，与相关文献报道结果一致。不同剂量的雷公藤红素与对照组比较均能降低荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度(MVD)；雷公藤红素4mg/kg组、雷公藤红素2mg/kg组和雷公藤红素1mg/kg组降低微血管密度(MVD)效果有差别，存在剂量依赖性；其中雷公藤红素4mg/kg组抑制效果最明显。可以推断雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长机制之一就是它能降低荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度(MVD)。Vogelstein B和 Kinzler KW 研究小组已经证实8：肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成在基因表达上有明显不同。这一发现为血管生成的基础和临床研究提供了重要资料。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，Jain RK和Carmeliet P提出9：肿瘤血管通过出芽、套叠、血管生成拟态等六种可能机制而新生。血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等均是已知强烈的促血管生成因子。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体-FGFR结合而介导实现的。血管内皮生长因子(VEGF) 与内皮细胞上的酪氨酸激酶受体VEGFR结合，通过Raf-MEK-MAP 信号转导途径而发挥其生物学作用10-11。Kubota Y认为应用不同的方法封闭或阻断VEGF/VEGFR信号转导途径均可抑制肿瘤的血管生成，进而抑制肿瘤的生长12。我们的研究结果提示雷公藤红素对bFGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达有显著下调作用，对VEGF蛋白表达没有影响。雷公藤红素影响荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)的原因可能是：（1）下调肿瘤组织中VEGFR蛋白表达，使VEGF的信号转导减弱, 明显降低了VEGF生物学效应的发挥，进而抑制内皮细胞的增殖和腔化；由于雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR-2蛋白表达存在剂量效应，更能抑制VEGF/VEGFR2所介导的血管内皮细胞分裂活性。（2）下调bFGF的蛋白表达，对抑制肿瘤血管生成有一定作用。雷公藤红素抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长的机制之一是其具有抗血管生成的生物活性。1. 周幽心, 黄煜伦, 许期年, 等. 雷公藤单体体外抑制胶质瘤细胞的实验研究. 癌症, 2002, 21(10):1106-1108.2. 黄煜伦, 周幽心, 周 岱, 等. 雷公藤红素抑制血管生成的实验研究. 中华肿瘤杂志, 2003, 25（5）:429-432.3. 周幽心，姜华，陈学彬，等.雷公藤红素对荷SHG44胶质瘤裸鼠的抑瘤试验J.中国神经肿瘤杂志，2005，3(4): 262-2664. 黄煜伦, 周幽心, 姜华, 等.雷公藤红素抑制可移植性人脑胶质瘤生长相关分子. 江苏医药，2007，33（1）：37-39.5. Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis- correlation in invasive breast carcinoma J. N Engl J Med, 1991, 324:1-86. Friedrichs K, Gluba S, Eidtmann H, et al. Overexpression of P53 and prognosis in breast cancer J. Cancer, 1993, 72: 3641-3647.7. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications J. N Engl J Med, 1971, 285 (21): 1182-11868. Croix BS, Vogelstein BV, Kinzler1 KW, et al. Genes Expressed in Human Tumor Endothelium J. Science, 2000, 289: 1197-1202. 9. Jain RK, Carmeliet P. Snapshot: tumor angiogenesis J.Cell.2012, 149(6):14081408.e1.10. Carmelite P, Jain RK. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis J. Nature. 2011, 473(7347):298-307.11. Ucuzian AA,Gassman AA,East AT, et al. Molecular mediators of angiogenesis. J Burn Care Res.2010, 31(1):158-75.12. Kubota Y. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy J. Keio J Med. 2012, 61(2):47-56.图1.荷SHG-44胶质瘤裸小鼠Fig.1.BALB/c nude mice with SHG-44 glioma表1 荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤体积（s,cm3）Tab 1 The bulk of xenografts in nude mice with SHG-44 glioma（s,cm3）groupnmeasurement123456A100.16770.02460.23210.05470.77900.17151.19990.26041.78920.36762.84900.3937B60.16260.02530.20140.03110.37010.07470.68130.24541.04900.24251.85180.5492C60.16280.02520.22970.04640.49580.17460.79570.27971.37500.42832.08120.6170D60.15730.05010.24860.08220.60010.28360.93700.29201.54160.44162.48370.73