缺氧缺血对新生大鼠松果体AANAT基因表达和MLT合成的影响.doc

8缺氧缺血对新生大鼠松果体AANAT基因表达和MLT合成的影响丁欣1 ，姜善雨2 ，冯星 ，何军3 ，孙斌1，朱雪明1(1苏州大学附属儿童医院新生儿科，江苏苏州215003；2无锡妇幼保健院儿科，江苏无锡214002；3苏州大学第一附属医院江苏省血液病研究所，江苏苏州215006）摘要 目的 旨在了解缺氧缺血性脑损伤（HIBD）对松果体合成褪黑素功能的影响，探讨松果体功能改变在HIBD中的意义。 方法 采用60只7日龄SD大鼠随机分成HIBD模型组和假手术组，模型组按改良Levine法建立。然后用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和放免技术分别测定并比较缺氧缺血后0、6、12、24、48小时松果体中芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶（AANAT）mRNA的表达水平及血浆褪黑素（MLT）的浓度。 结果 1. 松果体中AANAT mRNA的表达在HIBD后6小时、12小时、24小时低于对应假手术组（P0. 05或P0. 01）；假手术组各时点之间AANAT mRNA的表达水平无明显变化。 2.血浆MLT在HIBD后12小时、24小时血浆MLT水平均低于对应假手术组；假手术组各时点之间MLT浓度水平无明显变化。 结 论 HIBD早期松果体合成褪黑素的功能下降，下调AANAT的基因表达可能是其功能下降的“引擎”。降低了MLT的内源性保护作用可能参与早期HIBD的发病机制。 作者简介：1。丁欣（1981-），女，四川眉山人，住院医师，医学硕士，从事儿科临床工作，研究方向为新生儿脑损伤。 2姜善雨（1974-），男，江苏东台人，副主任医师，医学硕士，从事儿科临床工作，研究方向为新生儿脑损伤。二者同为第一作者。资金来源：关键词 缺氧缺血性脑损伤；芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶; 信使核糖核酸；褪黑素 The Influences of HIBD on Pineal AANAT mRNA and Melatonin Level in Neonatal RatDING Xin 1,JIANG Shanyu2, FENG Xing，HE Jun3 ,SUN Bin1，ZHU Xueming1 (1.Department of Pediatrics, Childrens Hospital Affiliated to Soochow University, Suzhou Jiangsu 215003,China;2. Department of Pediatrics, Wuxi maternal and Child Health Hospital, Wuxi Jiangsu 214002, China;3. The First Affiliated Hospital of Soochow University; Jiangsu Institute of Hematology; Key Laboratory of Thrombosis and Hemostasis; Ministry of Health; Suzhou 215006; China)Abstract Objective To elucidate the influences of HIBD on pineal melatonin-synthetic function and explore the possible significance of pineal function alterations in HIBD. Methods 60 seven-day-old rats were randomly divided into 2 groups. Semi-quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was used to measure melatonin-synthetic enzymesarylalkylamine-N-acetyltransferase (AANAT) mRNA expressions in pineal gland and Radioimmunoassay(RIA) for plasma melatonin levels. Results 1. The AANAT mRNA amounts of 6h, 12h, 24h after HIBD were lower than that of corresponding sham-operated groups（P0. 05或P0. 01），and that of all sham-operated groups were very much alike; 2. The plasma melatonin levels of 12h, 24h after HIBD were lower than that of corresponding sham-operated groups. The melatonin levels of all sham-operated groups were similar; Conclusions Pineal melatonin-synthetic function is impaired on early HIBD stage. Down-regulation of AANAT gene expression is likely the “engine”. Knock-down of endogenous protective process of MLT maybe plays a part in early HIBD pathogenic mechanism. Key words: hypoxic-ischemic brain damage; arylalkylamine-N-acetyltransferase; mRNA;melatonin 新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是围产期窒息缺氧导致的缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）性疾病，其存活者可遗留永久性神经系统后遗症，如脑瘫、智力低下、癫痫、语言障碍和共济失调等1, 严重影响患儿的生存质量。深入研究脑损伤的发病机制对于选择合适的干预措施，减轻后遗症具有重要意义。褪黑素（melatonin, MLT）是松果体合成分泌的一种吲哚类激素，它除了具有镇静、抑制性腺、调整生物钟外，还有强大的清除氧自由基、抗氧化作用, 以及保护DNA、膜脂质、线粒体免受氧化损伤2和维持神经胶质细胞功能。至今国内外尚无研究缺氧缺血性脑损伤与松果体功能关系的报道。我们实验小组在前期的实验中发现新生大鼠HIBD后松果体等神经细胞凋亡增加3，外源性MLT对缺氧缺血后皮质海马损伤有神经保护作用4，故我们期望在形态学基础上进一步观察新生大鼠HIBD后松果体细胞中AANAT mRNA和血浆中MLT水平的变化，探讨松果体功能改变在HIBD中的意义，为MLT用于临床治疗HIE以及基因治疗HIE奠定基础。1、 材料方法1.1 实验动物 采用无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）7日龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，许可证SCXK（苏）2002-0008，雌雄不限，体重11-14g。在光照-黑暗（light-dark，LD）交替条件下饲养，由母鼠自由哺乳。动物房室温维持在25士2。LD光制采用LD(12: 12)即12小时光照(光照期06: 00-18:00)与12小时黑暗(黑暗期18: 00-06: 00)交替。1.2 动物分组及处理60只新生大鼠随机分成2组，每组30只，分组如下： HIBD模型组：在HIBD后第0、6、12、24、48小时设5个时间点，假手术组（sham-operated group）：时间点同上。制作模型时仅分离出左颈总动脉，不予结扎，缝合皮肤后放入相同恒温箱中饲养，不予低氧处理。模型制作参照改良Levine法5。选用7日龄新生SD大鼠，乙醚吸入麻醉，固定于手术板上，取仰卧位，在颈部正中作1cm左右的纵型切口，分离皮下组织和肌肉，在左侧胸锁乳突肌深面与气管之间找到并游离出左颈总动脉，以3-0号丝线双层永久性结扎，缝合切口。手术结束后将大鼠放在33暖箱中恢复1-2小时，然后进入事先置于33暖箱中的密闭常压低氧舱，给予湿化的8%氮氧混合气2小时，流量为2L/min，测氧仪监测氧浓度，模型制作完毕后回母鼠身边饲养。两组取材时间（HIBD后0小时为清晨0时，余推算）、地点、光线均相同；取材时节：9-11月。血标本：采用眼球摘除法取血，每只幼崽取血约0.15-0.3ml，肝素法分离血浆，-20冰箱保存备用。1.3.1 RT-PCR检测AANAT mRNA表达 采集松果体标本参照Kuszak6法摘除松果体。按TRIzol 试剂盒说明书提取总RNA。逆转录后，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定松果体中AANAT mRNA的相对表达量。引物根据大鼠AANAT基因文库参照文献设计，上海生物工程技术有限公司合成。用UVIDoc成像分析系统软件测定电泳后各泳带灰度，与内参-actin做比值半定分量析后进行统计。AANAT引物序列为：（预期产物443 bp）: 5-TGAGCGCGAAGCCTTTATCTCAGT;3-TGTGGCACCGTAAGGAACATTGCA1. 32血浆MLT水平的检测 血浆MLT水平用智能放免软件分析系统利用LOGIT-LOG回归法测定浓度。 标准品，NSB管做双份平行实验。1. 4 统计学处理 采用SPSS10.0医学统计软件。所有结果用均数标准差（）表示。组间均数比较用t检验。多组均数比较用Least-significant difference(LSD)检验。当p0.05时认为差异有统计学意义。2、结果21 松果体中AANAT mRNA的表达HIBD后6小时、12小时、24小时AANAT mRNA的表达水平均低于对应假手术组，而HIBD后0小时、48小时结果与对应假手术组相比无统计学差异；多组均数比较显示，假手术组各时点之间AANAT mRNA的表达水平无明显变化，HIBD后6小时开始下降，12小时达低谷，24小时有所回升，48小时恢复（见图1，2）。图1 AANAT mRNA电泳图*表示与对应假手术组对比P0. 05; *表示与对应假手术组对比P0. 01。表示HIBD组AANAT mRNA表达与前一时点相比P0. 05。图2 新生大鼠松果体中AANAT mRNA的表达2.2 血浆MLT水平HIBD后12小时、24小时血浆MLT水平均低于对应假手术组，而HIBD后0小时、6小时、48小时结果与对应假手术组相比无统计学差异；多组均数比较显示，假手术组各时点之间MLT浓度水平无明显变化，HIBD后12小时下降，24小时与12小时MLT水平基本相等，48小时恢复（见表1）。表1 新生大鼠各组血浆MLT浓度水平（pg/ml） 组别 0小时 6小时 12小时 24小时 48小时HIBD组 90.6515.6187.3714.7459.229.02*48.918.46*92.1715.88假手术组 99.1823.3183.1211.9488.768.2781.2010.390.6813.92均n=6 *表示与对应假手术组对比P0. 01。表示HIBD组AANAT mRNA表达与前一时点相比P0. 05。3、讨论松果体是人类以及哺乳动物的一个重要的神经内分泌中转站，合成MLT需经过一系列酶促反应。其中，AANAT为限速酶，在松果体中有表达。在哺乳动物和人类，MLT的合成路径主要是下丘脑视交叉上核（SCN）接受神经信息发放刺激信号通过交感神经元释放去甲肾上腺素，后者与松果体细胞的肾上腺素能受体结合，激活腺苷酸环化酶(AC)，提高胞内cAMP水平，促进AANAT的基因转录、翻译，从而增加MLT的合成。3.1 HIBD对松果体中AANAT mRNA表达的影响本实验结果表明,各假手术组之间AANAT mRNA的表达水平无变化，未曾显示昼夜不同，不考虑手术影响因素与文献报道新生大鼠8天后出现AANAT mRNA昼夜节律相符合。HIBD后AANAT mRNA表达6小时开始下降，12小时达低谷，24小时有所回升，48小时恢复，结合文献探讨其可能机制与下丘脑SCN生物钟控制的扳机作用，自由基的释放，细胞凋亡的增加7，兴奋性氨基酸毒性，下丘脑-垂体-肾上腺轴8的应激状态，NO合酶神经变性作用9等因素有关。3.2 HIBD后外周血中MLT的水平变化本实验参考Gorbet DJ实验法测定50l血浆标本MLT的浓度，可以发现各假手术组之间MLT水平无变化，此支持Ribelayga C等证实的新生大鼠11天后形成MLT昼夜节律。MLT水平的下降迟滞于AANAT mRNA表达的下降，推测可能与AANAT核酸水平至蛋白水平变化以及MLT释放入血有时间耽搁有关。另外本实验发现HIBD后MLT与AANAT mRNA变化并不完全一致，MLT下降时限短，这与El Allali K10的发现一致，即二者表达可以不一致，考虑可能与AANAT的转录后水平调节有关，另外是否与病理状态下机体有代偿性保护机制促进MLT释放入血有关，因为我们并未直接测松果体中的MLT的水平，亦或与RT-PCR法敏感度较高有关，其原因还有待于进一步实验研究 。3.3 初步探讨HIBD与松果体功能的关系 我们发现HIBD早期MLT降低，推测降低MLT的内源性保护作用可能参与早期脑损伤的发病机制，然而明确确切的HIBD与松果体功能的因果关系还需大量的进一步研究。我们的实验发现HIBD后12-24小时MLT减低，48小时即恢复提示MLT治疗HIBD的窗口期可能较短。临床上一般HIE在生后12小时至24小时症状最明显，本研究结果亦显示新生大鼠HIBD后12小时至24小时外周血MLT处于低水平状态，由此可见松果体功能与HIBD的病情进展可能相关，因此建议在HIBD早期给予MLT使其在脑组织中处于高水平，从而可能提高神经细胞存活率，减轻脑组织缺氧缺血性损伤。已有实验证明：就远期效应上，在HIBD之前和之后使用外源性MLT，虽然不影响大鼠成年后的生长和行为发育，但能显著改善行为的不协调性和学习能力缺陷11。另外本实验发现HIBD中MLT合成的关键酶AANAT的基因表达下降先于MLT的下降，故我们认为下调AANAT的基因表达可能是HIBD早期松果体合成褪黑素功能下降的“引擎”。本实验仅初步探讨了HIBD与松果体功能的关系，要阐明松果体功能在HIBD发病机理中的作用及开辟治疗新途径还需继续开展相关系列的深入研究。参考文献1 金汉珍，黄德珉，官希吉主编.实用新生儿学M，第3版，北京: 人民卫生出版社，2003，762-763.2 Al-Ghoul WM. Abu-Shaqra S. Park BG, et al. Melatonin plays a protective role in postburn rodent gut pathophysiologyJ. Int J Biol Sci, 2010, 6(3): 282-293.3 孙斌，冯星，张瑞宣等.新生鼠脑损伤后松果体细胞的一氧化氮合酶与细胞凋亡关系的初步研究J。神经解剖学杂志，2002，18（4）: 347-350.4 杨祖铭，冯星，孙斌等。 褪黑素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的实验研究J。 中华儿科杂志， 2006, 44(6):467-468. 5 Ikeda T, Mishima K, Yoshikawa T, et al. Dexamethasone prevents long-lasting learning impairment following neonatal hypoxic- -ischemic brain insult in ratsJ. Behavioural Brain Research, 2002, 136(1): 161-170.6 Kuszak J, Rodin MA. A new technique of pinealectomy for adult ratsJ. Experientia, 1977, 32(3): 283-284. 7 Hutton LC. Abbass M. Dickinson H. et al. Neuroprotective properties of melatonin in a model of birt