小剂量17β-雌二醇对预防卵巢切除大鼠骨丢失的研究.doc

小剂量17-雌二醇对预防卵巢切除大鼠骨丢失的研究卫生研究 1999年第4期第28卷 论著作者：高秀辉薛延颜卉君郑铭豪单位：北京市创伤骨科研究所骨与关节病研究中心100035关键词：卵巢切除大鼠；雌二醇；骨质疏松；骨生物力学参数摘要为观察生理剂量的17-雌二醇(E2)对卵巢切除大鼠骨代谢、骨密度和骨力学特性的影响。将大鼠分为假手术组(A)、去卵巢组(B)和去卵巢并给雌二醇组(C)。给E29周后同时处死各组大鼠。结果B组大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)水平明显上升，右股骨近端1/3及第三腰椎骨密度(BMD)明显低于对照组，雌二醇可逆转上述情况。B组骨力学参数明显低于对照组，而C组力学参数未见好转。结论认为生理剂量E2可抑制骨吸收和骨形成并增强骨量，但骨强度未见明显改善。 中图分类号R713.6Q579.13R591.1Effect of physiological dosage of estrogen on the preventionof bone loss in rats induced by ovariectomyGao Xiuhui,Xue Yan,Zheng Minghaoinstitute of Traumatology & Orthorpaedics,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing100035，Chinathe effect of small dosage of 17-estradiol(E2) on bone metabolism,bone mineral density (BMD) and biomechanical properties of bone in ovariectomized rats were observed.Twenty-one rats were divided into three groups.They were sham-operated group (A),ovariectomized group(B),and ovariectomized and treated with 17-estradiol group (C).Rats were sacrificed after 9 weeks of treatment.Serum alkaline phosphatase(ALP) and osteocalcin(OC) contents were significantly increased;bone mineral content(BMC) of right femur and the third lumbar body(L3) and the biomechanical properties of right femur were decreased in group B.Treatment with E2 can reverse the changes of BMD and BMC in ovariectomized rats.There was no significant improvement on biomechanical parameters in group C rats.It is concluded that physiological dosage of E2 may inhibit bone resorption and bone formation and increase bone mass,but it may not improve the strength of bone.Key words: ovariectomy,estradiol,osteoporosis,bone biomechanical property雌激素替代疗法防治骨质疏松症已应用于临床，但对其作用机理还有待于进一步阐明。本实验旨在了解生理剂量的17-雌二醇(E2)对卵巢切除大鼠骨量、骨转换和骨力学特性的影响，从而探讨E2预防骨质疏松的机理。1材料与方法1.1动物模型与分组选用3月龄雌性Wistar大鼠，体重(20914)g(中国医学科学院动物中心提供)，饲料含钙0.51%，含磷0.42%，自由饮水，光照时间固定。在中日友好医院临床研究所动物实验室饲养。将大鼠随机分为3组，每组各7只：假手术组(A)，去卵巢组(B)，去卵巢并给17-雌二醇组(C)。对A组大鼠开腹找出卵巢但不切除。对B组切除双侧卵巢。对C组切除双侧卵巢后即按体重每周皮下注射E2(0.05mg/kg)。A组、B组则平行注射含相同乙醇浓度的色拉油。1.2实验方法实验为期9周，每周称重一次。5周以后用代谢笼收集24小时尿液。处死前眼眶取血，分离血清，-20保存。处死后取出子宫、胸腺、脾并称重。将右股骨剔除软组织，测骨密度(BMD)后，再测骨力学指标及骨矿物质含量(BMC)。第三腰椎(L3)测BMC。1.2.1血、尿生化指标血清碱性磷酸酶(ALP)：以磷酸苯二钠为底物的显色反应，510nm比色。血清雌二醇(E2)：ELISA试剂盒(BIORAD)批内与批间CV分别为3.9%和6%。骨钙素(OC)：ELISA试剂盒(丹麦Osteometer A/S公司)批内与批间CV分别为4.5%和10.6%。尿羟脯氨酸(HOP)：其水解产物与二甲基苯甲醛结合后的生成物在510nm比色测定。尿肌酐(Cr)：碱性苦味酸盐法，520nm比色。尿钙(Ca):邻甲酚酞络合酮法，575nm比色。1.2.2骨密度用双能X线骨密度测量仪(DXA，美国 Norland XR-26)测量右股骨骨密度，精密度为1%。1.2.3生物力学实验将右股骨用流变仪(英国Stevens-KTS-25)进行三点弯曲实验，加载速度为8mm/min，跨距为15mm。记录载荷变形曲线，由曲线计算弹性能密度，并据截面惯性矩计算应力、弹性模量等生物力学指标。1.2.4骨矿物质含量(BMC)将右股骨去除两端干骺部，用牙科锯平均分为三部分，分别置于105烤干至恒重后称重；在650焚烧炉中48h后再称重。灰重与干重的比值表示BMC含量。腰椎(L3)也按上述方法测定。1.3数据处理用t检验比较组间差异。结果均用xs表示。2结果2.1体重变化B组大鼠手术后体重明显增加，9周后，显著高于A组和C组，后两组体重无明显差异(图1)。图117-2对卵巢切除大鼠体重的影响2.2内脏器官重量卵巢切除组子宫角萎缩，切除卵巢并给E2组又恢复到正常水平。卵巢切除组的脾、胸腺明显增大，切除卵巢并给E2组与假手术组无差别(图2)。图217-2对卵巢切除大鼠器官重量的影响2.3血尿生化指标B组大鼠血清OC和ALP水平比A组明显升高(P0.05)。B组血清E2低于A组，但无显著差异。C组血清OC和ALP均明显低于B组(P0.05)。给E25周后，三组尿中HOP/Cr及Ca/Cr比值无显著差异。给E29周后，C组尿HOP/Cr明显低于B组(P0.05)(表1)。2.4骨密度(BMD)三组大鼠的右股骨骨密度无明显变化。若用大鼠体重校正2，C组和A组明显高于B组(P0.01)，但C组未达到A组水平(表2)。2.5骨矿盐含量(BMC)B组右股骨远端和中间1/3部分的BMC与A组无明显差异。而B组近端1/3的BMC明显低于A组(P0.01)，C组可使BMC回升，明显高于B组，但低于A组。L3的变化与股骨近端1/3变化趋势一致(表2)。表1血尿各项生化指标组别血液HOP(mg/g Cr)Ca(mg/g Cr)E2(pg/ml)ALP(UL)OC(ng/ml)5周末尿9周末尿5周末尿9周末尿A13.592.363.10.69.410.7311.363.2055.785.936229287B10.064.854.70.6（1）12.500.89（2）7.971.8648.0510.794717368C19.643.28（3）2.10.3（1，3）11.400.83（1，4）6.391.0729.861.725711406与A组比较，(1)P0.05(2)P0.01；与B组比较，(3)P0.05(4)P0.01表2骨密度和骨矿物质含量(xs)组别股骨截面直径(mm)股骨股骨矿物质(g/cm)第3腰椎矿物质(g/cm)横径纵径骨密度(g/cm2)骨密度/体重近端1/3中部1/3远端1/3A3.070.092.280.070.1210.0064.470.150.6910.0060.6710.0080.6280.0150.5580.008B3.070.112.290.050.1080.0023.390.15(1)0.6480.004（1）0.6690.0100.6230.0210.5410.009（1）C2.960.062.380.040.1100.0013.820.12（2，4）0.6630.006（1，3）0.6670.0040.6250.0030.5480.006（2，3）与A组比较，(1)P0.01；与B组比较，(2)P0.05(3)P0.012.6生物力学参数2.6.1截面的变化B组的股骨截面形状与A组无明显差异，C组截面的纵径变大而横径变小，使形状趋于圆形(表2)。2.6.2各项生物力学参数弹性载荷、弹性挠度、弹性应变、最大应力、弹性变形位能、最大应变在去卵巢后均明显降低，而弹性载荷、弹性挠度、弹性应变、弹性应力、弹性变形位能在给E2后不但没有回升而且明显降低(P0.05)，C组的最大应变明显回升(P0.05)。弹性模量、最大挠度、结构硬度三组之间无明显差异(表3)。表3大鼠股骨生物力学的变化(xs)组别最大载荷(N)最大挠度(mm)弹性载荷(N)弹性挠度(mm)最大应力(N/mm2)弹性应力(N/mm2)A124.75.80.750.1186.845.600.420.09185.510.3128.98.6B122.26.50.690.0479.784.31（1）0.300.02（1）159.97.1（1）104.28.4C111.63.30.680.0467.351.98（3）0.240.02（4）165.79.199.65.6最大应变 (%)弹性应变(%)弹性模量(N/mm2)弹性变形位能(Nmm2)结构硬度(N/mm)A5.70.93.20.7520888617.953.78258.541.7B4.60.7（1）2.30.2（1）499552011.881.13（1）278.522.0C5.30.4（2）1.90.2（2）47219709.731.14（2）296.519.6注：与A组比较，(1)P0.05；与B组比较，(2)P0.053讨论B组大鼠由于雌激素缺乏而导致体内一系列的变化。其中体重的增加是由于卵巢切除后脂代谢紊乱造成脂肪堆积的结果。给E2后可以逆转这种情况。B组大鼠子宫角萎缩，C组子宫角恢复到对照组(A)重量。胸腺和脾是淋巴细胞成熟和聚集的地方，可分泌调节骨代谢因子，如IL-6，IL-1等。去卵巢后胸腺及脾重量明显增加，可能是免疫系统代偿性的反应。B组大鼠血清E2水平下降，而反映骨形成的指标血清ALP和OC水平明显升高；反映骨吸收的指标尿HOP/Cr、Ca/Cr无明显变化。而C组血清ALP和OC及尿HOP/Cr比值均下降，说明骨转换受抑制。与Yeh报道相似，用骨密度仪测量大鼠右股骨BMD无显著性差异3。但用体重校正BMD值后，C组明显高于B组，而且BMC的变化与BMD一致。由于雌激素降低时，松质骨的变化更敏感。因此松质骨含量较高的股骨近端1/3和L3的BMC在B组明显降低，而C组又明显回升。虽然其骨量未恢复至A组水平，但E2抑制骨丢失作用是明显的，其作用程度可能与给E2剂量和时间有关。Li等报道给E2后，去卵巢大鼠骨密度和骨强度改善不明显4。本实验表明给生理剂量的E2后，BMD和BMC均明显增加，但骨力学参数无明显改善。这种给E2后骨密度增加而骨强度并无改善的情况也反映在给氟化物5，6。这是因为骨强度不仅与骨的材料力学而且与骨结构力学性质(如骨小梁结构、连接、截面积大小等)有关。随着年龄增长，横向骨小梁变薄或消失，骨质疏松会使骨结构损坏，与骨量丢失共同导致骨折危险性增加7。本实验结果提示生理剂量E2可抑制骨转换和改善松质骨骨量，但对骨强度改善不明显。(致谢：在此对崔伟副研究员的指导和支持表示衷心感谢。)作者简介：高秀辉，女，赴澳大利亚博士生颜卉君北京师范大学生物系郑铭豪澳大利亚西澳大学外科系参考文献1.Turner CH,Burr DB.Basic biomechanical measurements of bone:a tutorial.Bone,1993,14:5956082.Hietaia EL.The effect of ovariectomy on peristeal bone formation and bone resorption in adult rats.Bone Miner 1993,20:57653.Yeh JK,Aloia JF,Barilla ML.Effects of 17-estradiol replacement