近红外光谱法.ppt.ppt

1 近红外分光光度法 nir 技术简介 一 概述近红外光区 nearinfrared nir 是指波长在780 2526nm的电磁波 是人们最早发现的非可见光区域 距今已有近200多年的历史 进入80年代后期 近红外光谱分析技术迅速得到推广 成为一门独立的分析技术 有关近红外光谱的研究及应用文献几乎呈指数增长 在药学领域也已有大量文献介绍近红外光谱分析技术的应用 2 通过测定被测物质在近红外谱区的特征光谱并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后 对被测物质进行定性 定量分析的一种分析技术 近红外分光光度法具有快速 准确 对样品无破坏的检测特性 可广泛应用于药品的理化分析 包括 离线 供试品的检测和直接对 在线 样品进行检测国外药典收载情况 usp bp ep中国药典2005版首次收载附录xixk近红外分光光度法指导原则 3 nir的特点 分析速度快 分析效率高适用的样品范围广 液体 固体 半固体和胶状体 样品一般不需要预处理 分析成本较低测试重现性好不破坏样品 应用在活体分析和医药临床领域不适合痕量分析以及分散性样品的分析 4 二 基本原理 1 波长范围约在780 2500nm 波数约为12800 4000cm 1 5 2 分子的不同振动形式 对称伸缩振动 非对称伸缩振动 摇摆振动 摇摆振动 弯曲振动 剪切振动 6 3 近红外光与物质的作用形式 真溶液 乳浊液近红外光照射到透明真溶液上 光在试样中透射时发生吸收 分析光在样品中经过的路程 光程 一定 透射光的强度与样品中组分浓度的关系符合beer定律 用于测定时称为透射分析测定法 近红外光照射到乳浊液上 因为样品是浑浊的 样品中含有对光产生散射的颗粒 光在试样中透射时 除发生吸收外还会发生多次散射 光在样品中经过的路程不确定 透射光的强度与样品浓度间的关系不符合beer定律 用于测定时称为漫透射分析测定法 也可用于固体 半固体分析 7 固体 半固体发生镜面反射 漫反射 吸收 透射 折射 散射等作用方式近红外光与固体样品作用示意图1 镜面反射 2 漫反射 3 吸收 4 透射 5 折射 6 散射 8 样品对光漫反射示意图s 镜面反射 d 漫反射 9 4 近红外光谱常规分析方法 a 透射式b 漫反射式c 漫透射式1 光源2 单色器3 样品4 检测器透射分析和漫透射分析测定光源与检测器处在样品的两侧 漫反射分析测定光源与检测器处在样品的两侧 10 11 含氢基团 包括 c h 甲基 亚甲基 甲氧基 芳基等 羟基o h 羧基等 巯基s h 氨基n h 伯胺 仲胺 叔胺和铵盐等 等 合频近红外谱带位于2000 2500nm处 一级倍频位于1400 1800nm处 二级倍频位于900 1200nm处 三级和四级或更高级倍频则位于780 900nm处 5 有机化合物的近红外光谱谱带归属 12 13 不同化合物基团在近红外区的吸收谱带 14 不同化合物基团在近红外区的吸收谱带 15 分子振动从基态向高能级跃迁时产生的 记录的主要是含氢基团c h o h n h s h的倍频和合频吸收 不同基团或同一基团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别 具有丰富的结构和组成信息 非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量 16 6 近红外光谱定量分析依据 对于透明真溶液 近红外透射光谱符合朗伯 比尔定律 漫反射分析定量公式 17 漫反射吸光度a和k s的关系 18 使用反射吸光度时的光谱加和性 对于含n种组分的混合样品 由于各组分分子对光的吸收和散射是相互独立的 因此可得吸光系数的加和性 即任一波长 处混合物样品总的吸光系数kmix等于各组分吸光系数之和 19 近红外漫反射光谱不具备光谱吸光度的加和性 近红外漫反射光谱不能像经典多组分分析那样通过光谱吸光度的加和性建立并解联立方程组 解得各组分的浓度 来实现多组分分析 20 三 近红外漫光谱分析中常用的计算方法 对特定的样品体系 近红外光谱特征峰的分析需要通过对光谱的处理减少以至消除各方面因素对光谱信息的干扰 再从差别甚微的光谱信息中提取样品的定性或定量信息 21 近红外光谱分析常用的计算方法为多元校正方法主要包括 多元线性回归 multivaratelinearregression mlr 主成分分析 principlecomponentanalysis pca 主成分回归 principlecomponentregression pcr 偏最小二乘法 partialleastsquire pls 人工神经网络 artificialneutralnetworks ann 方法等 22 mir pcr和pls属线性回归方法 主要用于样品的质量参数为线性关系的关联 mlr方法计算简单 物理意义明确 易于理解 但对参加关联的变量 如波长通道 数目有限制 由于仅使用几个波长下的光谱数据 这样常常会丢失许多光谱信息 建立mlr模型要求训练集样品的个数多于变量数目 即使这样 它仍对许多质量参数均获得较好的结果 mlr方法计算简单 物理意义明确 易于理解 但对参加关联的变量 如波长通道 数目有限制 由于仅使用几个波长下的光谱数据 这样常常会丢失许多光谱信息 建立mlr模型要求训练集样品的个数多于变量数目 即使这样 它仍对许多质量参数均获得较好的结果 23 四 近红外分光光度分析方法 样品集选择 用标准方法测定样品 测量光谱数据 光谱预处理 波长选择 建模 模型验证 24 1 样品集选择 首先搜集一批样品 再精选代表性样品 并将样品集分为校正集和验证集 用来建立模型的校正集样品应涵盖以后要分析样品的范围 校正集中应包含除待测成分以外所有的背景信息 使校正产生的数学模型能将这些背景加以扣除 25 2 用标准方法测定样品 对一个模型 有必要选用一个为大家所接受的 权威的参考方法 对样品的组成或性质进行分析 并用测量结果和对应的光谱建立模型 在验证模型时 使用模型预测验证集样品 将预测值和已知值比较 来验证模型预测的准确性 26 3 测量光谱数据 透射光谱法 适用于透明样品的分析 定量关系符合比尔定律 漫透射光谱法 适用于能对光产生散射效应的样品的分析 比尔定律不适用 如乳液体系 漫反射光谱法 几乎适用于各类样品的分析 如不透明 固体 半固体样品的分析 27 nir光谱仪 光源 溴钨灯 发光二极管分光系统 滤光片 光栅 干涉仪 声光可调滤光器载样器件 液体样品 石英或玻璃样品池固体样品 积分球或特定的漫反射载样器件光纤 定位或在线分析中检测器数据处理分析系统 28 4 光谱预处理 吸收强度较弱信噪比低样品状态 测量条件等造成的光谱不确定性背景复杂 谱峰重叠 现代近红外光谱分析的信息处理技术 29 导数光谱 导数光谱可有效地消除基线和其它背景的干扰 分辨重叠峰 提高分辨率和灵敏度 但它同时会引入噪声 降低信噪比 30 平滑算法 常用的信号平滑方法有移动平均平滑法和savitzky golay卷积平滑法 平滑处理涉及处理窗口的大小 较大的平滑点数可以使信噪比提高 但同时也会导致信号的失真 31 多元散射校正msc 主要是消除颗粒分布不均匀及颗粒大小产生的散射影响经过散射校正后的光谱有效地消除了原始光谱由于颗粒度及装样误差所导致的基线平移和非线性影响 人参总皂甙近红外光谱及定标建模分析 32 5 波长选择 建模波段过宽 必然包含大量冗余信息 波段选择有利于简化模型 提高模型预测精度 由于各成分分子结构存在差异 使得各自对应的最优建模波段并不相同 分段波长的组合 也可以是连续全光谱 或区域光谱波长 近红外光谱法测定复方丹参滴丸中的3种有效成分 33 建模主成分数的选择 在建模过程中 采用不同的主成分数 模型的预测能力也会有较大的差异 因此合理确定参加建模的主成分数是充分利用光谱信息和滤除噪音的有效方法之一 预测残差平方和法 press 使用一定数目的主成分建立模型 然后用这个模型对参加建模的每个样品进行预测 计算press值 press越小 说明模型的预测能力越好 使用press对主成分数作图 确定最佳主成分数 34 6 建模 建立样品光谱与质量参数之间的对应关系 称为校正模型 定性 分类 定量 回归 35 建立定性模型的方法 有监督的模式识别 pca无监督的模式识别 lda simca ann svm 36 定性模型的应用 鉴别和定性原料药的鉴别 赋形剂和活性成分的控制 中间体的质量控制 图谱库的优化和建立多晶形 polymorphism 其他 产地 假药鉴别 指纹图谱 药物混合均匀度的监控 生物技术产品度 37 7 模型验证 对建立的校正模型必须通过验证集样本的测量 来评价模型的好坏 校正集预测误差均方根rmsec 用于衡量校正集样品预测结果的准确性 验证集预测误差均方根rmsep 用于衡量验证集样品预测结果的准确性 相关系数r2 表示样品预测值与理论值的相关程度 38 近红外光谱定量分析的流程与步骤 39 拓扑学方法和ann方法等常用于非线性关系的关联 ann和pls方法结合使用 可改善数据关联的能力 40 建立定量模型的方法 mlr只要知道混合物中某些组分的浓度或性质 就可以建立复杂体系的校正模型 但是仅适用几个波长下的光谱数据 常常会丢失许多光谱信息 plsr该法是一种全光谱分析方法 并能滤去原始数据噪音 提高信噪比 解决交互影响的非线性问题 pcr不需要知道校正样品中的所有组分浓度 就可以建立被测组分的校正模型 某些主成分与组分浓度无任何关系ann其抗干扰 抗噪音及强大的非线性转换能力 对于某些特殊情况 ann会得到更小的校正误差和预测误差 41 定量模型的应用 物理参数 硬度 粒度 溶解度多晶形测定水分测定含量测定冻干粉生物技术其他 药物包装的厚度 42 优点 1 快速 通常30秒内就可给出分析结果 可进行在线分析 2 制样简单 3 信息量大 可同时测定多组分 4 经定标建模后 无须用其他常规化学分析手段 不使用有毒有机试剂 无污染 5 非破坏性分析 可实现产品的无损质量检测 6 可使用光纤 从而可实现远程分析检测 43 1 建立模型需要大量有代表性且化学值已知的样品 2 模型需要不断的维护改进 3 近红外测定精度与参比分析精度直接相关 在参比方法精度不够的情况下 无法得到满意结果 缺点 44 测定方法 透射光谱法和反射光谱法 透射光谱法把待测样品置于作用光与检测器之间 检测器所检测到的分析光是作用光通过样品体与样品分子相互作用的光 若样品是透明的真溶液 则分析光在样品中经过的路程一定 透射光的强度与样品组分浓度由比耳定律决定 45 反射光谱法 检测器与光源置于待测样品的同一侧 检测器检测到的分析光是光源发出的作用光投射到物体后 以各种方式反射回来的光 物体对光的反射分为规则反射光 镜面反射 与漫反射 规则反射光指在物体表面按入射角等于反射角的反射定律发生的反射 漫反射是光投向漫反射体 颗粒或粉末 后 在物体表面或内部发生的方向不定的反射 46 功能 定性分析和定量分析 定性分析利用模式识别与聚类的一些算法 主要用于鉴定 在模式识别运算时需要有一组用于计算机 学习 的样品集 通过计算机运算 得出学习样品在数学空间的范围 对未知样品运算后 若也在此范围内 则该样品属于学习样品集类型 反之则否定 聚类运算时不需学习样品集 它通过待分析样品的光谱特征 根据光谱近似程度进行分类 47 定量分析 近红外光谱分析与其它吸收光谱按照比耳定律作定量分析类似 作常规光谱定量分析时 需要建立光谱参数与样品含量间的关系 标准曲线 对复杂样品作近红外光谱定量分析时 为了解决近红外谱区重叠与谱图测定不稳定的问题 必须充分应用全光谱的信息 48 应用范围 食品酒制品 饮料 调味品 乳制品 食用油 烘焙食品 肉类等成分鉴别 产地鉴别 真伪鉴别农牧谷类作物 烟草 咖啡 水果 蔬菜 茶叶等成分鉴别 成熟度 品质分级 品种鉴定 产地鉴别 真伪鉴别石油炼制原油 天然气 汽油等成分鉴别 重整 49 主成分分析pca 将多波长下的光谱数据压缩到有限的几个因子空间内 再通过样品在各因子空间的得分确定其归属类别 基本的降维及显示技术 50 五 附录xixk近红外分光光度法指导原则 定义及收载背景通过测定被测物质在近红外谱区 波长约在780 2500nm 波数约为12800 4000cm 1 的特征光谱并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后 对被测物质进行定性 定量分析的一种分析技术近红外分光光度法具有快速 准确 对样品无破坏的检测特性 可广泛应用于药品的理化分析 包括 离线 供试品的检测和直接对 在线 样品进行检测国外药典收载情况 usp bp ep应用范围化学分析定性分析定量分析过程控制 51 附录xixk近红外分光光度法指导原则 续 应用范围化学分析定性分析 可对药品的活性成分 辅料 制剂 中间产物 化学原料以及包装材料进行鉴别定量分析 可定量测定活性成分和辅料 测定某些脂肪类化合物的化学值 如羟值 碘值和酸值等 水分测定 羟基化程度测定以及溶剂量的控制过程控制物理分析晶型和结晶性 多晶性 假多晶性和粒度测定溶出行为 崩解模式 硬度测定薄膜包衣性质检测制剂过程控制 如对混合制粒过程的监测 52 附录xixk近红外分光光度法指导原则 续 仪器及其性能指标的控制仪器 由光源 单色器 或干涉仪 检测器 数据处理和评价系统等组成指标控制 波长 光度线性 噪声测量模式 透射式测量透光率 t 漫反射模式测量反射率 r 影响近红外光谱的主要因素 样品的温度 样品的含水量和残留溶剂 样品的厚度 样品的化学性质 多晶型和样品的实际贮存时间等 53 附录xixk近红外分光光度法指导原则 续 应用近红外分光光度法进行分析的基本要求定性分析 首先建立参数谱库 然后进行数据预处理和数据评估 最后对数据库的专属性和耐用性进行验证定量分析 首先建立一个校正模型的参考谱库 然后进行数据的预处理 最后进行方法学验证 五 近红外分光光度法在药品生产中的应用 55 1 对生产原料的质量评价 药物加工过程中第一步就是原料的鉴定 近红外光谱分析通过光导纤维将传感探头与近红外分析仪相连接 可以在原料进入生产车间时 立刻检测每种每批生产原料的质量 整个定性定量分析可以在很短时间内完成 真正保证了产品质量 同一类型的原料中多变因素主要是湿度和颗粒大小 近红外光谱在湿度测定中的灵敏度及其适于固体表面的表征的特性 使它能够很快地得到样品的湿度和颗粒大小的信息 然后将原料进行分类 该方法与传统的中红外光谱和湿化学方法相比 在1年内可节省几百个工时 56 2 对药物制剂的分析 对固体制剂的分析 固体药剂是很重要的一类药剂 大部分药剂都是固体剂 如片剂 丸剂 散剂 胶囊剂及颗粒剂等 固体的物理性质如颗粒大小 湿度及结晶度等对药物的稳定性 溶解性及在人体内的吸收及生理获得性 bioavailability 等都有很大的影响 因此在药物的配方和加工过程中 固体药剂的物理表征就至关重要 近红外光谱在固体药剂物理表征方面的应用是该技术在制药工业中最成功的应用 由于近红外光在固体中的穿透程度相对较深以及其容易采用反射技术的特点 使它成功地用于固体药剂的各种物理化学性质如湿度 含量均一性 颗粒大小分布 结晶度及硬度的定量表征 57 固体药剂一般是通过磨碎 混合 制粒 压片或装入胶囊及包装等过程制备的 各种固体原料的颗粒大小及分布会影响每一步加工过程及最终的产率 因此实时测定和控制每一步加工过程中固体原料的颗粒大小及分布对配方和加工过程都非常重要 由于近红外光很容易被颗粒散射 使得近红外光谱结合漫反射技术可以快速 非破坏性测定固体药剂中各种成分包含活性组分 配剂及赋形剂的颗粒大小及分布 孙美玲等应用近红外漫反射技术成功地测定了铝塑包装盐酸氨溴索片及中间体与克拉霉素胶囊中的主成分含量 58 大部分药物都可以形成几种结晶形式或多晶形 当化学性质相同时 不同的结晶形式所处的能级不同 这种能级差将影响药物的溶剂化作用 亦即影响药物的溶解速度 从而使病人对药物的吸收速度也不相同 最常用的晶形测定方法是热分析法 该方法的缺点是样品用量少 这就需要从极少量样品的分析结果得出整个样品的结构信息 误差较大 另外 该方法需要毁坏样品 因而不能重复测定同一样品 中红外光谱在测定样品的结构信息方面非常有用 但由氢键效应引起的二级和三级结构信息只有在近红外区才能观察到 另外 中红外技术所采用的各种样品处理方法如磨碎或溴化钾压片都会破坏样品的晶体结构 而且磨碎过程中加入的热能也会改变样品的结晶形式 近红外光谱可以无需特殊的样品制备过程 很容易区别固体药剂中各种结晶形式 同时测定其光学异构体的含量 与多元线性回归方法相结合 近红外光谱是一种最佳的非破坏性质量控制手段 用于测定光活性物质的异构体纯度 59 近红外光谱在固体药剂的物理表征方面的应用还有湿度 混合均匀性 密度 粘度 硬度及片剂镀膜的分析测定等 由于其非破坏性的特点 用该方法分析完的样品可以继续进行其它分析测定 或包装后再销售 早期的近红外在固体制剂分析都是利用溶剂将药物从制剂中提取出来以后 再进行近红外光谱的测定和处理 再得到分析结果 近红外光谱分析在药学中应用的又一次飞跃是将其直接用于固体样品的分析 而不需要将固体样品转化为液体状态进行分析 这是药物分析中的一个里程碑 因为它将近红外分析方法的应用扩展到许多药物过程中 近红外技术不再限制在分析实验室里 而是可以直接用于生产现场 因为分析前无须使用使用溶剂如氯仿 四氯化碳等进行提取 60 对液体制剂的分析 1966年 sinsheimer和keuhnelian使用近红外光谱对一系列有药理活性的铵盐在溶液状态下进行了考察 在2150 2320nm范围内对溶液样品进行了定量分析 zappala和post研究了一种用于注射剂和混悬剂中甲丙氨酯含量分析的近红外分析方法 样品用氯仿和水进行萃取 dubois等报道了测定滴耳液中五种成分的方法 该滴耳液中含两种活性成分 安替比林和利多卡因 两种溶剂 乙醇和甘油 和一种抗氧剂 硫代硫酸钠 结果表明 近红外光谱法能够很好地对两种溶剂和一种活性成分安替比林进行定量 另一种活性成分利多卡因在制剂中的浓度仅为1 正好处于仪器的检测限上 因此方法的准确性不够 61 kumar和raghunathan使用近红外光谱考察了反相胶束体系卵磷脂 非极性溶剂 水中形成的水的性质 三种非极性溶剂分别是苯 四氯化碳和环己烷 在卵磷脂胶束溶液中存在两种类型的水 一种是在有机相中的分散水 另一种是溶解在反相胶束内部的水 结果表明 对所有三种有机溶剂 存在于有机相中的水量是可以忽略的 62 ciurczak和torlini对多组分液体制剂的定量分析进行了研究 在20 乙醇水溶液和2 5 山梨醇基质中有三种药物 乙酰氨基酚 磷酸可待因和马来酸氯曲米通 其含量分别为0 6 0 3 和0 12mg ml 校正集浓度在80 120 用多元线性回归处理数据 得到相关系数分别为0 984 0 993和0 999 平均偏差分别为1 1 0 3和0 1 molt k 等利用nirs测定了甲糖宁片剂中甲苯磺丁脲的含量 buchanan b r 等应用nirs非侵入性地定量测定了薄膜包衣片片心中活性成分 kamat m s 等快速无损测定了小玻璃中中冻干蔗糖中的残留水分孙美玲等应用近红外透射光谱快速非侵入式定量分析了甲磺酸甲替沙星注射液中的主成分 63 3 药物加工过程的在线监控 粉末混合过程控制主药与赋形剂进行混合工序sekulic等在混合器的旋转轴上加了一个漫反射光纤探头 当探头与混合粉末接触时 与之相连的近红外光谱仪就能够实时地采集粉末的光谱信息 然后运用多变量统计分析技术等化学计量学方法来判断何时混合均匀程度达到要求sekulic等应用nirs对10 苯甲酸钠和赋形剂39 微晶纤维素 50 乳糖和1 滑石粉的混合过程进行了非破坏性在线监测 64 制剂生产的过程控制 rantanen j 等在线检测了流动床上颗粒尺寸berntsson o 等在线检测了大批量明胶硬胶囊中的水分含量kirsch j d 等在线探测了薄膜包衣过程 69 近红外光谱分析开始应用于药物制剂分析时 与常规分析方法区别不大 样品要先经过提取 分离等步骤 然后再进行近红外光谱分析 近红外光谱技术已得到药品质量管理部门的重视 美国f