5／6肾切除肾衰大鼠致心肾综合症模型的实验研究.doc

56肾切除肾衰大鼠致心肾综合症模型的实验研究中国现代药物应用2oo9年8第三卷第15期cin0dgg20Q.:!5/6肾切除肾衰大鼠致心肾综合症模型的实验研究王晶晶陈丁丁【摘要】目的建立sD大鼠心肾综合症动物模型.方法采用大鼠5,6肾切除法造模,经饲养后,比较假手术组和模型组血生化及内分泌指标,评价该模型的心肾功能.结果与假手术组相比模型组出现明显的慢性肾功能衰竭症状,血清肌酐尿素氮甲状旁腺素水平显着升高,及心血管系统的并发症,包括左心室肥厚,血管顺应性降低.结论大鼠5/6肾切除模型形成慢性肾衰模型后引发心血管并发症,该模型可适用于对心肾综合症的药物治疗研究.【关键词】大鼠5,6肾切除;慢性肾功能衰竭;心肾综合症.Cardiorenalsyndr0me.mS,6nepIIrect0mjzedrats彻g如,enD一dfDep,r眦nc咖nceu咖e2D0D9,【Abatract】objectivesetupacardiorenalsyndr01neanima1modelinspraguedrdWleymts.Metll0dsSDmtswererandomlydividedint0no珊alcontrolshamgr0up,modelcontmlgmup.Model0fCRFwasconstructedby5,6nephrectomy.After68weeks,renalfunction,albumin(Alb)inurine,bloodmutine,b10odelectr0lyteandp帅thyrin(PIH)weredetected.fIhen,atthe8thweek,changesoftheleftventriculartissuewereobservedaswel1asthecontractionofthemt,sthoracicaorta.ResllItsComparedthnomalrats,thelevels0fsemmbloodureanitrogen(BuN),creatinine(cr)weremaTkedlyelevatedincRFrats,whilethe1evelsofA1binurinemarkedlyincreased.tjssue.Them0de10fCRFcausecardiovascu1ardisease,includingventdcularbypertr0phyandchanges0ftheth0racicaonac0mp】iance.condusj0nThem0de】0f5/6nephrect0mycausecardiovasculardisea8e.Itcanbeusedinresearchingthedmg0fanticardi0renalsyndmme.【Keyworls】5/6nephreetomy;Chmnicrena1failure;Cardiorenalsyndmme心肾综合症(cardiorenalsvndr0me)是由于慢性肾功能衰竭(chr0nicrenaJfajlure,CRF)引起的心血管并发症(caLrdi0vasculaurc0mplication),是肾衰患者死亡的一项重要因素【1,无论是接受透析的终末期肾病(Endstagerenaldisease,EsRD)的患者还是处于肾衰12期的患者心血管并发症的病死率均可达5O%.另一方面,充血性心衰患者中亦约有50%的患有慢性肾病,且其病死率与其肾功能的恶化程度密切相关圆.因此,对肾衰模型心血管系统病变的研究,对深人理解心肾综合症发病机制和开发心肾综合症治疗新药,具有重要意义.本实验采用经典5/6肾切除大鼠模型f31,对其肾功能,内分泌指标,以及主要对其心血管系统的病理生理指标进行了研究和评价.1材料1.1实验动物清洁级雄性SD大鼠32只,体重(18010)g,由中科院上海实验动物中心提供.1.2试剂戊巴比妥:进口分装,批号wS20o80118.大鼠血清甲状旁腺素(Parothn,PrIH)ELIsA试剂盒:RapidBioLab批号04280505.苯肾上腺素作者单位:210o09南京市中国药科大学临床药学教研室通讯作者:陈丁丁?论着?(Phenyl印hrinehydmchl0ride):Sigrna,批号116Kl492.乙酰胆碱(Acetv1ch0line):Sig锄,批号l16K0689.硝普钠(SNP):上海山浦化工有限公司,批号20o5年11月l0日.左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME):si肿a,批号108H1294.头孢拉定:山东鲁抗医药股份公司,批号071004.高磷高钙定制饲料(Ca:1.13%;P:0.94%):南京汤山龙泉鼠颗粒饲料.1.3仪器P.O.BOX100.Fin一01621酶标仪:Vantaa,Fjnland.BL一420F生物机能系统f四道生理信号处理系统):成都泰盟生物科技有限公司.自动生化分析仪:L)(一20,Beckm锄,us.2方法2.15/6肾切除模型的制备5/6Nx模型组(5,6Nx,n=20)制备方法:采用大鼠肾大部分切除的方法,以4%戊巴比妥钠(40mg)麻醉动物,俯卧固定于手术台上,局部剪毛,右侧肋下脊直肌外侧常规消毒,无菌操作下切开右背侧皮肤各层,暴露右肾,分离固定,按上极,下极弧形切右肾组织,主要切除皮质,用明胶海绵压迫止血,待血止后缝合包扎,切除的右肾?2?中国现代药物应用2O09年8月第3卷第l5期ChinJM0dDmgAp口1,Aug2Oo9,V0l_3,No.15组织约0.450.5g,约占一侧肾脏皮质的2,3.术后1周做第2次手术,同样方法麻醉,切开左背部,暴露左肾,结扎肾蒂,切除左肾,注意不要伤及肾上腺脚.假手术组(Sh锄,n=12)制备方法:以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后,仅作背部切口,分两次剥离左右肾包膜,保留肾上腺.模型组和假手术组在手术前一天及术后两天均给予头孢拉定(ip,300mg/l【g).所有大鼠饲养条件:室温24,12h光照,l2h黑暗,充足水供和饲料.其中动物饲料为较普通饲料钙磷含量稍高的定制饲料(ca:1.13%;P:0.94%).常规饲养,于6周和8周进行相关实验指标的测定.2.2生化指标测定5/6肾切除后6周和8周对大鼠都进行生化指标测定,主要观察其动态变化,能反映模型的稳定性及发展状况.6周和8周取血前,将大鼠置代谢笼24h,收集尿液用双缩脲方法测定尿液总蛋白(T0talPr0teinsinurea).并以0.17%戊巴比妥钠(35mg)麻醉,眼球静脉丛取血,制备血清进行血清肌酐(semmcreatinine,scr),尿素氮(Bloodureanin,BUN),总钙(T0talcalcium),总磷(TotalPhosphate)含量测定.血清H含量采用大鼠血清HEUSA试剂盒测定.2.3左心室指数取大鼠心脏,用生理盐水洗净淤血,去除多余脂肪组织,取左心室,称全心及左心室重量,得左心室重量指数:左心室/全心重(LVw/Bw),左心重/体重(Hw/Bw),全心重,体重(Lvw/Hw).2.4心肌形态学检测取完整左心室浸泡于4%PBS甲醛溶液(PH=7.4)固定,送东南大学病理教研室制作病理切片,石蜡包埋,HE染色,电镜观察拍照.2.5主动脉血管反应性测定分离大鼠胸主动脉,去除血管周围脂肪与结缔组织后,将血管修整为长约3岫的血管环,用不绣钢丝挂钩将其悬挂于内盛37Krebs溶液并通以95OInl门L和5Orn儿CO2的混合气(pH7.4)的肌槽中.Krebs溶液组成(g:Nac16.9169,KC1O.3499,NaHCO32.O998,MO40.2901,KH2PO4O.1604,cacl20.2663,葡萄糖1.9994,乙二胺四乙酸(EDTA)0.o26,pH7.4.血管环在肌槽中平衡后,实验全部在1.0g静息张力下进行.收缩反应性通过加入累积浓度苯肾上腺素(I)henylephine,PE)(10mol门L一10mo儿)测得;舒张反应性是由测定10mol门LPE预收缩后血管环对硝普钠(SNP,去内皮)或乙酰胆碱(Ace哆lch0line,Ach,有内皮)累积浓度(10mo儿1旷mol,L)的反应程度,其中,用棉签或镊子轻刮血管环内表面,经苯肾上腺素收缩后,乙酰胆碱不能舒张或舒张低于30%即表示内皮已除,或用左旋硝基精氨酸甲酯(LNAME)(10胁ol/1)预处理15IIlin.由硝普钠舒血管作用以其引起的舒张幅度占PE收缩幅度的百分比表示.肌张力变化信号经等长张力传感器经BL一420F生物机能系统采集转换后,记录分析.由所得数据制作累积浓度一效应曲线.2.6血清二胺氧化酶含量测定二胺氧化酶(DAO)是具有高度活性的细胞内酶,正常状态下主要存在于哺乳动物小肠粘膜绒毛上层,肾和胎盘组织,在病理状态下如多器官功能衰竭,肾功能衰竭时组织器官细胞缺血受损,细胞内DAO释放人血,致血清DAO升高,测定血清DA0活性可反映组织细胞的损伤程度,对研究机体损伤程度有指导意义.本实验采用改进AaursenPN的方法昀,测定大鼠血清DAO活力.3结果3.1一般情况假手术组大鼠表现机警,反应快,皮毛致密,整齐而有光泽,饮食正常,体质量逐渐增加;模型组大鼠精神萎靡,活动迟缓,皮毛蓬松,枯槁无光泽,甚至弓背蜷体,食欲减退,体重增加缓慢.经5,6肾切除术后8周末,共死亡5只,存活率8O%.3.2生化指标从表13可以看出,模型组在手术后6周已出现明显的肾衰特征,与假手术组相比模型组肌酐浓度升高123%,尿素氮升高18l%,总钙降低3%,总磷升高20%,而尿液总蛋白含量则升高了200%,甲状旁腺素升高了154%,8周与6周模型组与假手术组相比均未见太大波动,保持稳定的水平,从测定结果来看本实验模型出现典型的肾功能衰竭症状,与常规的肾衰模型的生化指标变化表现一致(见表1,表2).3.3左心室重量指数模型组左心室指数的三个指标与假手术组比较,其中LVw/Bw,LVwmW有显着性差异(见表3).结果表明经过5/6肾切除肾衰引起大鼠左心室肥厚.表l经5,6Nx后肾衰大鼠模型组与假手术组的生化指标比较P(0.05vsShalTt(veIlicle);P<O.OlvsshaIIl(vehicle);中国现代药物应用2oo9年8月第3卷第l5期chinJModDrugApp】,Aug2o09,V01.3,N.15表2经5/6Nx后肾衰大鼠模型组与假手术组血清甲状旁腺素浓度比较P<0.O5vsSharn(vehicle);P<O.O1vsSharIl(vehicle);表3经5,6Nx后肾衰大鼠模型组与假手术组左心室重量指数比较P<O?O5Vssham(vehicle);P<O?OlVsSh锄【vehicle);3.4心肌形态学检测HE染色后观察切片(见图1),与假手术组对比,5,6肾切除模型组明显出现心肌细胞肥大,心肌纤维化.3.5主动脉血管反应性3.5.1收缩反应模型组血管对苯肾上腺素收缩反应在浓度为1010mmol/l时显着性大于假手术组的收缩幅度,Ec50右移.(见图1)结果表明,随着肾功能衰竭的发展,在一定程度上使血管平滑肌细胞对苯肾上腺素敏感性加强,收缩幅度加大.3.5.2舒张反应10mmol/l的苯肾上腺素预激后,选择累积终浓度1O10mmol/l的乙酰胆碱进行舒张反应(见图2),从10mmol/l开始,假手术组的舒张与模型组有明显的差异,同一浓度下的舒张程度大于模型组的,在10mmol/l时有显着性差异,而去内皮后对硝普纳的反应呈现出舒张一致性,未发现有明显差异.(见图3).表明5/6肾切除肾衰模型组内皮系统受到损伤.3.6血清DAO含量测定结果采用改进AarsenPN的方法测定血清的DA0活力,根据结果可看出模型组酶活力与假手术组相比,有显着性差异.说明机体受到损伤影响导致细胞释放大量DAO人血,引起DAO酶活力升高.表4.经6后大鼠模型组与假手术组血清D60活力P<0.05vsSh啪(vehicle);P<0.Olvssh哪(vehicle);4讨论黧?3?心肾综合症是近年来临床上关注的问题,在肾病患者中,无论是代偿期和失代偿期,还是终末期肾病心血管疾病的病发率和病死率都大大提高,尤其是终末期肾病患者.据调查表明,在澳大利亚,新西兰两国家,由心肌梗死,尿毒症心肌炎等心血管疾病导致死亡的人数占透析人数的40%网.心肾综合症传统的定义是由于肾功能的损伤引起心血管疾病并发症的机体综合性疾病,表现出心肾功能不全综合症.现阶段,对心肾综合症的深入研究,其定义加入新的内容,主要是指急性(或慢性)心脏或者肾脏功能不全经由一些列神经体液反馈机制引发二者功能性紊乱的综合症.而并非只由肾病引发,心脏疾病也可引发心肾综合症,强调了二者密切联系的整体性.也由此将心肾综合症分为五种类型.急性心源性心肾综合症(cRstype1,acutecRs),由于心脏受到急性损伤如休克等引发急性肾损伤;慢性心源性心肾综合症(cRs帅e2,chmniccRs),由于心脏慢性损伤如慢性心功能不全引发慢性肾损伤;急性肾性心肾综合症(cRst)rpe3,acuteren0cardiacsy11dr0me),主要是急性肾小球炎引起的心律不齐,心肌缺血等心功能变化;慢性肾源性心肾综合症(CRS哆pe4,chmnicrenocardiacsyndmme),主要是慢性肾功能不全引起心衰,左心室肥厚,舒张期障碍,以及全身血管顺应性降低的心血管并发症,本实验研究的即是该类型心肾综合症;cRsty1)e5(sec0ndarycRs)是由于其他综合性疾病包括败血症,糖尿病等引发的心肾功能紊乱.随着对心肾综合症的关注,其发病机制及相关影响必将受到广泛的重视.在本实验中切除大鼠肾组织后,肾单位绝对数目大幅度降低,单位负荷加大,出现肌酐,尿素氮明显升高,血磷升高,尿总蛋白升高.尿总蛋白量是衡量肾血管内皮渗透性功能的指标嘲,乙酰胆碱是血管内皮依赖型舒张剂,综合尿总蛋白量升高及血管对乙酰胆碱反应敏感性降低说明了血管受到损伤.主要是由于肾单位排磷量下降,肾脏合成活性维生素D(1.252(OH)一VD3)水平下降,低水平的钙离子刺激甲状旁腺分泌甲状旁腺素导致其水平提高.研究资料表明高磷,低钙,高甲状旁腺激素是肾功能衰竭引发血管钙化(calcification)的重要因素.血管钙化主要是指钙磷盐在全身中小动脉内膜沉积形成病AB图1.大鼠胸主动脉图1.心室肌HE染色病理切片形态学观察.对不同浓度PE的收A:假手术组200,B:5/6Nx模型组20o缩反应图2.预收缩大鼠胸主动脉后对不同浓度Ach的舒张反应图3.预收缩大鼠胸主动脉后对不同浓度sNP的舒张反应?中国现代药物应用2oo9年8月第3卷第l5期chinJM0dDmgAppl,Aug20o9,vol-3.N0.15理斑块,容易引起瓣膜狭窄,降低血管顺应性,随时有猝死的危险.血管钙化是慢性肾病引起心血管并发症的主要特征,其伴随肾衰从12期开始出现并在终末期引发明显的全身陛中小动脉硬化.影响产生血管钙化的因素有很多,其中钙磷乘积,和甲状旁腺素的升高能诱导其产生,而一些抑制性蛋白的表达也能引发其产生,如胎球蛋白一A,骨保护素,骨桥蛋白,基质Gla蛋白.研究表明,这些蛋白主要抑制羟基磷灰石在细胞上的黏附,阻止羟基磷灰石晶体的生长,促进组织钙化吸收,抑制矿化作用fl1.因此随着肾病的发展,体内钙磷乘积的变化导致这些抑制性蛋白表达量相对不足诱发组织钙化.从心脏功能来看,随着肾衰由代偿期到失代偿期,机体出现排泄功能降低,血容量升高,心脏负荷加大,出现心肌缺血,观察模型组左心室病理切片发现心肌细胞肥大,心肌纤维化,结构发生重构,左心室指数与假手术组也有显着性差异.另一方面肾脏分泌功能受损,肾血管内皮细胞分泌的红细胞生成素以及醛固酮水平下降,血氧降低12】,心脏及各组织器官回血量增加,血管收缩,加重心肌肥厚.引发血压升高,反过来加重心肌负担,加重心肌缺血,恶化心肌肥厚,随时可引发心力衰竭和心律失常导致死亡,机体心肾功能障碍导致组织DA0释放人血,因此模型组血清DAO活力与假手术组比有显着性差异.实验结果表明,大鼠经过两次手术后6周能稳定形成肾功能衰竭模型.血清肌酐,尿素氮是反应肾排泄和分泌功能的常规指标,模型组接近假手术组的两倍,并且在6周和8周保持一个比较稳定的水平,因此常规实验中选择6周作为模型制备终点是合理的.由肾功能衰竭引发一些列包括血管顺应性降低,左心室肥厚,血清甲状旁腺素升高在内的心血管系统,内分泌系统的改变,出现明显的心肾综合症.常规的心衰模型,仅是加重心脏负荷,引起心肌组织重构,引起心肌肥大,导致心功能不全,本模型主要突出慢性肾功能衰竭的同时其心血管系统在功能结构上的影响及改变.随着临床研究对心肾综合症的不断深入,本实验对心肾综合症疾病动物模型的建立以及治疗药物的开发和研制有着重要意义fl3_.参考文献【1】MaeUjessup,MaaRosaC0staIlzo,etalTheCardiorenalSyndmmeD0WeNeedaChange0fStmtegyoraChange0frlactics?,J叫mal0f山eAmericrdnC0llege0fCardi0logy2oo9,53:5979【2】RalfWe8tenfeld,WilliJahnenDechent,etalV8scularCalcificti0nandFe【llinAD瓿ciencyinChr0nicdneyDisease,TrendsCardi0vascMed2007.17:l24128【31ShuichiTsumoka,KentaNishiki,etalChm0ph删ac0logyof假calcitriolin5/6nephrectomizedI.ats41A.Imam,M.Aigbe,etal,Theeffect0fIGF一1andEnal叩riltllerapy0nrenalfuncti0nandtubularap.ptosisingmwingratswimchr0nicrenalfailure,KidneyandHypertension,2ooO,13(4):286A一287A5AarsenPN,KempA.Rapidspectmph0t0metricmicrometh0df0rdeterrninati0n0fhjstaminaseactivityrJ】.Nature,l964,2O4:l196】Dori8T.chfdn,AshleyB.Irish,etal,DysIipidaemiaandcardi0renaldisease:mechanism8,therapeutic.pportunitiesand