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山 西 师 范 大 学硕士研究生学位论文开题报告书论文题目 蕤核生物碱的提取及分离纯化 研究生姓名 王艺苗 所在学院 生命科学学院 年 级 2009级 学科方向 植物学 导师姓名 魏学智教授 山西师范大学研究生毕业(学位)论文开题报告姓 名王艺苗专 业植物学导师姓名魏学智研究方向论文题目: 蕤核生物碱的提取及分离纯化选题的目的和意义:(一)蕤核简介蕤核（Prinsepia uniflora Batal. ）,是蔷薇科扁核木属(Prinsepia Royle)的一种多年生落叶灌木，主要分布于我国山西、陕西、河南、甘肃、内蒙古和四川等省区1。目前，有关蕤核的研究非常少。蕤核对生长环境和土壤条件要求不严，一般黄绵土上均能生长，具有抗旱、喜光、耐寒、耐瘠薄、适应性强等特点。蕤核扎根深，根系发达且根蘖力强，地上部分枝叶繁茂，既易于修剪，又能截持一定量的降雨。据有关文献报道2, 6年生扁核木每公顷地上生物量为18.62t，可截持降雨量6.39t。每1m2扁核木林地在1m深土层中的根重达306g,总长度达361.4m。蕤核果实营养丰富，斯琴等3的研究表明蕤核果实含有维生素B1、维生素B2、维生素C、胡萝卜素和叶酸5种维生素和16种氨基酸，还含有Ca、P、Zn、Fe、Se等多种无机元素。此外，果实粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的含量均较高，尤其是粗纤维的含量，高达28.56% ,可食用或酿酒；种仁不仅可入药，而且含油率高(约32%)，可作榨油原料。目前对蕤核的研究非常少，主要集中在蕤核形态特征描述、育苗栽培2以及光合特性4 这些方面，但未见蕤核中生物碱研究的报道，因此，为将蕤核作为一种资源植物更好的进行开发，本文以提取其果实和叶片中的生物碱为目的进行研究。（三）生物碱简介生物碱是一类重要的天然含氮有机化合物，广泛分布于植物界（主要是裸子植物和被子植物中），动物中分布的极少。关于生物碱的确切定义，至今没有固定的答案。刘湘、汪秋安5将生物碱定义为生物体内一类除蛋白质、肽类、氨基酸及维生素B以外含氮化合物的总称，是结构复杂具有生理活性的植物碱。目前，人们共识的生物碱至少应具备以下几个特点6： 至少含一个氮原子7；不包括分子量大于1500D的大多数肽类化合物6；具有碱性、中性7；氮原子源于氨基酸嘌呤母核或甾体与萜类的氨基化，且位于环内或环外或链状结构内7；排除上述简单定义中所有例外的化合物7。生物碱大多具有生物活性，往往是许多药用植物的有效成分，有些甚至是中草药的有毒成分。大多数生物碱都具有显著的生理活性,如长春花碱(vinblastine)是一种具有明显的抗肿瘤活性的二聚吲哚类生物碱8；喜树碱(CPT)是五环类抗肿瘤生物碱,它对头颈部肿瘤、胃癌、结肠癌和白血病等多种恶性肿瘤均有显著的疗效9；临床主要用于治疗胃癌、膀胱癌、白血病等。利血平毒性较低，能降低高血压。小檗碱10,11对葡萄球菌、链球菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等多种病菌有较强的抑制或杀死作用。实验还表明，生物碱pergularinine和tyllophorinidine能显著抑制慢性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的胸苷酸合成酶的活性12，13。通过生物活性跟踪发现,从牛心朴子草中分离得到的7-脱甲氧基娃儿藤碱和N-氧代7-脱甲氧基娃儿藤碱均具有抗烟草花叶病毒(TMV)活性。从蝙蝠葛中提取出的蝙蝠葛苏林碱、从山莨菪中分得的樟柳碱等对偏头痛型血管性头痛、视网膜血管痉挛和脑血管意外引起的急性瘫痪都有较好的疗效14。蝙蝠葛根状茎中的酚性生物碱可通过抑制神经元Bax基因和上调Bcl-2基因的表达，保护心脑免受缺血再灌注损伤15。此外，该类化合物对昆虫的作用方式多样,如触杀、胃毒、不育、拒食、驱避、产卵忌避及抑制生长发育等16，17。目前，对蕤核(Prinsepia uniflora Batal)的研究报道很少见。本研究将采用超声波提取法对蕤核果皮、种子和叶片中的总生物碱进行提取，并采用碱性氧化铝柱层析法对粗提物进行分离纯化，以得到蕤核果皮、种子和叶片中的生物碱单体，并进一步对其含量和结构进行测定。国内外研究动态:目前，国外对蕤核的研究未见报道，国内对蕤核的研究也仅限于育苗栽培2、果实的营养成分3以及光合特性4 这些方面,因此可以说，对蕤核的研究非常少，有待于更多专家和学者对其做更深的开发和研究。相比蕤核，国内外有关专家和学者对生物碱的研究较为广泛，主要集中在研究特定生物碱的提取、分离与纯化方法18-22，生物碱的含量测定，生物碱的合成23-26，生物碱的结构表征27，生物碱的作用及机理。生物碱的提取方法较多，常见的提取方法有溶剂提取法、冷浸提取法、索氏提取法、超声波提取法、超临界流体提取法、膜蒸馏法、膜提取法、微波法28-30等。生物碱的含量测定方法有 中和法、重量法、比色法，高效液相色谱法31,32、交流示波极谱滴定法33、酸性染料比色法34,35、气相色谱法、毛细管电泳分析法36、荧光猝灭法37、薄层荧光扫描法38、薄层-胶束荧光法39等。生物碱的分离纯化方法有PH梯度萃取法40、薄层色谱分离法41,42、柱色谱法43-47、高速逆流色谱法48,49等。主要研究内容:1蕤核种子中生物碱的研究1.1生物碱的检识1.2总生物碱的提取2种子中总生物碱的分离纯化和结构鉴定2.1薄层层析（TLC）分析2.2碱性氧化铝柱层析法分离纯化蕤核种子总生物碱2.3生物碱单体结构鉴定和含量测定3 蕤核果皮和叶片中生物碱的研究实施方案:1蕤核种子总生物碱的提取1.1生物碱的检识生物碱在酸性条件下可与某些试剂生成不溶性复盐或配合物沉淀，常见的沉淀试剂有： 试剂类型试剂名称组成反应特征碘化物复盐类碘-碘化钾试剂KII2红棕色沉淀碘化汞钾试剂K2HgI4类白色沉淀碘化铋钾试剂KBiI4黄至橘红色沉淀重金属盐类硅乌酸试剂SiO212WO3nH2O淡黄或灰白色沉淀磷钼酸试剂H3PO412MO32H2O白色或黄褐色沉淀磷钨酸试剂H3PO412WO32H2O白色或黄褐色沉淀大分子酸类苦味酸试剂苦味酸黄色结晶苦酮酸试剂苦酮酸黄色结晶其它雷氏铵盐试剂NH4Cr(NH3)2(SCN)4红色沉淀或结晶以上是常用的能与生物碱反应生成沉淀的试剂，生物碱的沉淀反应可用来检测某种植物提取液中是否含有生物碱，也可以用来分离生物碱。1.2总生物碱的提取称取蕤仁粉末适量，加入2-3倍体积PH=3的80%乙醇，超声波提取1h，抽滤，得滤液，重复3次，合并滤液。60减压浓缩，得浸膏。浸膏用2% 的硫酸溶解，抽滤，滤液用氯仿萃取5-6次，除去其中的色素、鞣质等，弃去氯仿，酸水液用浓氨水梯度调节PH值，并依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得各段总生物碱，回收溶剂得各段总生物碱。具体流程见图1。2总生物碱的分离纯化和结构鉴定2.1薄层层析（TLC）分析 采用薄层层析法分析各段总生物碱。(1) 硅胶GF254板制备：将硅胶GF254与0.3% CMCNa水溶液按13（g/v）比例研匀，均匀涂铺于不同规格的玻璃板上，置室温风干12d，而后储存于干燥箱中备用。（2）展开剂的配制1)氯仿:苯:二乙胺（5：4：0.4）； 2)氯仿:二乙胺(9：1)；3)环己烷:氯仿:二乙胺(5：4：1)； 4)环己烷:二乙胺(9：1)； 5)苯:乙酸乙酯:二乙胺(7：2：1)； 6)氯仿:甲醇（9:1，氨水饱和板）；7)氯仿:丙酮:二乙胺（5：4：0.4）； 8)乙酸乙酯:甲醇:浓氨水（17：2：1）；9)乙酸乙酯:甲醇（17：2）。Ph=3，80%乙醇，超声波提取3次粉末减减压浓缩,回收溶剂滤液浸膏22%盐酸溶解，过滤2酸水液2氯仿相（弃去）2酸水相2氯仿萃取浓氨水梯度调节Ph值减水液减氯仿萃取2减压浓缩2氯仿萃取物减乙酸乙酯2氯仿层减减水液减乙酸乙酯层减正丁醇萃取减减水液减正丁醇层2减压浓缩2乙酸乙酯萃取物2减压浓缩2正丁醇萃取物减水液（弃去） 图1 蕤核生物碱提取流程（3）显色剂：改良碘化铋钾试剂、20%硫酸-乙醇、三氯化锑-冰乙酸（1:1）、三氯化锑-氯仿饱和液 (4) 层析及显色方法：将萃取样品用少量甲醇(氯仿)溶解，用毛细管点样于GF254硅胶板上，置展开缸中饱和510min，上行法展开，待展开剂跑到距硅胶板前沿1 cm时，取出，挥干溶剂。用改良碘化铋钾显色（直接喷雾改良碘化铋钾试剂），记录各板显色斑点的颜色，并计算Rf值。2.2碱性氧化铝柱层析法分离纯化蕤核种子总生物碱 (1) 碱性氧化铝柱层析采用干法装柱，将柱层析用氧化铝一次性倒入层析柱中，用洗耳球在柱外敲打，直到柱表面平整并不再下降为止，然后将柱下方与真空泵相连，抽气，以使柱子紧实。（2）上样采用干法上样，取适量粗生物碱样品加氯仿（甲醇）溶解，与少量氧化铝混匀，蒸干溶剂，取出，碾碎，上样，其上覆盖一张滤纸，以防淋洗剂加入时破坏样品层。（3）洗脱采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统（待定）洗脱，2滴/秒。每100ml收集一份。用薄层层析监测并合并相同馏分。（4）蕤核生物碱的制备薄层分离柱层析分馏后的馏分，选取监测效果相对好的进行进一步分离。3生物碱结构鉴定运用红外、紫外、核磁共振技术测定其结构。4蕤核果皮和叶片中生物碱的研究（方法同种子生物碱的提取）预期达到的研究结果:分离出蕤核果皮、种子和叶片中的生物碱单体，并测定出其结构和含量。参考文献1中国植物志M 2黄沿江,白且荣,郭喜莲.扁核木J.中国水土保持，1994，123斯琴，等.蕤核果实营养成分分析J.内蒙古草业，2007,14杨晓盆，张超，王文梅，张旺军. 扁核木光合特性的研究J.中国生态农业学报, 2008,16(4)5刘湘，汪秋安.天然产物化学M,20056Cordell G A, Quinn-Benttie M L,Farnsworth N R. 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