壳聚糖体外降解及降解产物对内皮细胞增殖的影响.doc

壳聚糖体外降解及降解产物对内皮细胞增殖的影响*【摘要】目的 研究壳聚糖体外降解的规律及不同降解时间其产物对血管形成密切相关的内皮细胞增殖的影响，为壳聚糖在组织工程血管化方面的应用提供参考。方法 以生理盐水为降解介质对壳聚糖膜进行体外降解，用失重率、黏均分子量变化和FTIR表征降解本体的变化规律，用降解液pH值和降解产物中氨基葡萄糖浓度变化表征降解产物的变化规律；将降解液与内皮细胞共培养，用MTT法检测内皮细胞增殖情况，并与氨基葡萄糖单体培养后内皮细胞增殖结果进行比较。结果壳聚糖膜在生理盐水中的降解是壳聚糖分子链中(1, 4) 糖苷键断裂引起的，降解缓慢，120 d失重率为19.48，降解过程中黏均分子量减小，最终产物为氨基葡萄糖，其浓度不断增大，降解产物的累积使pH值升高。不同时间降解产物中氨基葡萄糖浓度都在氨基葡萄糖单体促进内皮细胞增殖的范围内，前期和后期的降解产物促进内皮细胞增殖，但降解中期2190 d的降解产物对内皮细胞的增殖有抑制作用，表明氨基葡萄糖单体并非影响内皮细胞增殖的主要因素。结论 壳聚糖体外降解缓慢，降解最终产物为氨基葡萄糖，其降解产物对内皮细胞增殖在降解中期抑制，前期和后期促进，其主要影响因素不是氨基葡萄糖单体。本研究可为壳聚糖在组织工程血管化方面的应用提供参考。 【关键词】 壳聚糖；体外降解；降解产物；内皮细胞 Degradation of Chitosan in Vitro and Effects of Degradation Products on Proliferation of Endothelial Cells. SHI Guoqi,CHEN Yuanwei,DING Yulong,YU Xixun,ZHANG Xiaohua,WAN Changxiu. Abstract： Objective To study the degradation of chitosan in physiological saline and the effect of degradaion products on proliferation of endothelial cells, as well as to provide the reference for exploring the potential application of chitosan to promote angiogenesis in tissue engineering. Methods The degradation was prepared by immersing the films of chitosan in physiological saline under aseptic condition. The weight loss rate and molecular weight were measured. On the other hand, the pH value and glucosamine concentration of degradation products were measured with MorganElson method. ECV304, a human umbilical vein endothelial cell line, was used and cultured with the degradation fluid. Cell proliferation was detected with MTT assay. The fluids of glucosamine with different concentrations also were cultured and compared with ECV304. Results The degradation of chitosan went along by destroyed the β(1, 4) bond. The weight loss of chitosan was 19.48% in 120 d. The molecular weight decreased with the increasing of degradation time. The pH value increased slightly and the concentration of glucosamine increased always with the increasing of degradation time. The degradation products of 2190 d inhibited the cell proliferation, but promoted the cell proliferation on other degradation time. When the concentration of glucosamine was 10 μmol/L 1 mmol/L, the fluid promoted the cell proliferation. The glucosamine concentration of degradation fluid was or = 10 mmol/L the cell proliferation was inhibited. Conclusion The degradation of chitosan goes along by destroyed the β(1, 4) bond. The degradation products of 2190 d inhibit the cell proliferation, but promote the cell proliferation on other degradation time. The glucosamine concentration is not the only factor which influenced the endothelial cells proliferation. Key words：chitosan;degradation in vitro;degradation products; endothelial cells 壳聚糖(chitosan, CS)是甲壳素的脱乙酰化产物，在自然界中的储量非常丰富，是产量仅次于纤维素的第二大天然高分子，也是迄今为止发现的唯一天然阳离子碱性多糖。它的分子链是由β(1，4)2乙酰胺基D葡萄糖单元和β(1，4)2氨基D葡萄糖单元组成的共聚物，其结构单元氨基葡萄糖（glucosamine, GS）与细胞外基质中蛋白多糖分子链的结构单元相似。壳聚糖在体内可被降解为GS，被人体吸收，具有优良的生物相容性和生物可降解性，是理想的细胞外基质材料，已被广泛地应用于生物医学领域 。目前已利用壳聚糖成功地开发出人造皮肤，众多研究表明壳聚糖与皮肤细胞有良好的相容性。 分子量对壳聚糖的性质有很大影响, 不同分子量的壳聚糖性质差异很大, 有时甚至表现出截然相反的特性, 而壳聚糖的许多独特功能只有在分子量降低到一定程度时才表现出来 。 因此, 研究壳聚糖的降解就显得尤为重要。目前, 国内外学者提出的降解方法主要有化学降解、物理降解和生物降解3大类。而生物降解主要集中在利用溶菌酶、木瓜蛋白酶等酶降解方面 。人的血清中所含的溶菌酶对壳聚糖有明显的降解作用。而内皮细胞ECV304具较高的增殖活性，常规培养条件即可存活，可多次传代，满足对细胞需求量大的实验要求，并被广泛地用于生理或病理血管形成机理以及促血管或抑血管治疗方法和药物的研究和筛选。 但壳聚糖的降解产物的影响研究较少，同时，壳聚糖在体内的水解降解研究也鲜见报道，因此本文研究了壳聚糖体外水解规律，在此基础上初探了壳聚糖降解产物对内皮细胞的影响。 方法 仪器与材料 PHS3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）；UV754紫外可见分光光度仪（上海分析仪器三厂）；AE2568 CO2培养箱(日本SANYO公司)；BIORAD 680型酶标仪（BioRad 公司，美国）；IX71型倒置荧光相差显微镜（Olympus公司，日本）；壳聚糖（Mv2.4×105，脱乙酰度91.2，青岛海汇）；氨基葡萄糖（青岛海普，分析纯）；乙酰丙酮（成都科龙，分析纯）；对二甲胺基苯甲醛（成都科龙，分析纯）；MTT（sigma）；人脐静脉内皮细胞株ECV304（四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室）。 称取一定量的壳聚糖, 将其溶于2的乙酸水溶液中配成2% 的壳聚糖溶液,真空脱泡，用移液管移取25 mL 滤液, 涂布于洁净玻璃板上,将涂有壳聚糖溶液的玻璃板自然晾干, 再将玻璃板浸入到0.8%NaOH 水溶液中, 2 h 后取出, 用大量的水清洗至中性，室温晾干后揭膜。 降解实验 将膜剪成1.5 cm×1.5 cm的小块，干燥至恒重，称重，Co60γ射线辐照灭菌后，在超净台下分别放入灭菌小瓶中，按固液比1400加入高温高压灭菌的生理盐水，瓶口密封后，放入恒温水浴中进行降解实验，温度：(370.5)。在预定的时间取样，每个时间点设3个平行样，取样在超净台下进行。 壳聚糖降解本体和降解产物的表征 失重率的测定 降解后本体真空干燥至恒重后测失重率，失重率的计算公式：失重率（%）=（W0-W1）/W0×100%，其中W0是降解前本体的质量，W1是降解后本体的质量。 降解本体分子量的测定 乌氏粘度计测降解本体的特性粘度：在25，乙酸乙酸钠（摩尔比11）1水溶液为溶剂，用乌氏粘度计外推法测降解后本体的特性粘度，特性粘度与黏均分子量关系式为：η6.589×10-3M 0.88。 本体结构的变化 降解后的膜片，用真空干燥器干燥，剪成细小粉末，KBr压片法制样，傅立叶变换红外光谱(FTIR)检测结构。 降解液pH值的测定 标定后的pH计测不同时间降解液的pH。 降解液中氨基葡萄糖含量的测定 1)分析用溶液的配制 乙酰丙酮溶液：量取乙酰丙酮溶液3.5 mL，加1 mol/L碳酸钠溶液至50 mL（用前配制）；对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液：称取DMAB 0.8 g，加无水乙醇15 mL及盐酸15 mL，摇匀备用。2)标准曲线的绘制 配制浓度分别为0.8380、0.6704、0.5027、0.3352、0.1676 mmol/L的氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液，取每种浓度标准溶液1 mL于试管中，各加蒸馏水至5.0 mL。另加入乙酰丙酮溶液1 mL/管，摇匀，沸水浴加热25 min。取出，冰水冷却，再加DMAB溶液1.0 mL/管，再加入无水乙醇至10 mL，60 水浴保温1 h，冷却，室温放置30 min以上。以不含氨基葡萄糖盐酸盐的试管为空白对照，分光光度计于526 nm测吸光度。3)降解液中氨基葡萄糖浓度的测定 以降解介质生理盐水为空白对照，按2）处理壳聚糖降解液。526 nm波长下检测吸光度值，依据标准曲线公式计算氨基葡萄糖浓度。 细胞增殖检测 壳聚糖降解液 取对数生长期的ECV304细胞株，消化制成密度为3×104/mL的内皮细胞悬液，接种于96孔板,100 μL/孔,复种5孔，置含5%(V/V)CO2、（370.1）的培养箱内培养24 h，弃去原RPMI1640培养基，实验组分别加入100 μL降解液和100 μL新鲜培养基，阴性对照组加入100 μL生理盐水和100 μL培养基，空白对照组加入100 μL培养基，将培养板放在上述培养环境中分别保持1、2、3、4、5和6 d。待观察时间到后，在每孔中加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h，小心吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min后在免疫酶标仪上于490 nm波长测定各孔光密度(OD)值,计算相对增殖率（RGR）。 氨基葡萄糖 配制浓度分别为100、10、1 mmol/L,100、10、1 μmol/L,100和10 nmol/L的D氨基葡萄糖盐酸盐生理盐水溶液，无菌滤头过滤除菌，并按照上述降解液细胞增殖的方法进行不同浓度氨基葡萄糖的细胞增殖试验。 统计分析 对降解规律数据及MTT法所测吸光度（OD值）分别进行方差分析，用SPSS13. 0 软件进行统计学处理。 结果与分析 壳聚糖降解规律 失重率 图1是壳聚糖降解后本体的失重率曲线。可以看出，CS失重率随时间呈上升趋势。前30 d，失重率迅速升高；之后，变化趋于平缓，至120 d失重率达到19.48%。总的来说，CS在生理盐水中的降解缓慢。 分子量变化 图2是壳聚糖膜降解后本体黏均分子量变化曲线。从总体上看，分子量随时间逐渐下降，说明壳聚糖膜在生理盐水中发生了分子链的断裂而降解。 FTIR分析 CS膜放入生理盐水前（记为0 d）和浸泡1、7、30、120 d后的红外谱图分别对应图3中的a、b、c、d 和e曲线。可以看出，COH吸收峰（1 080.42 cm-1）强度随浸泡时间逐渐增强，表明COH逐渐增多。说明壳聚糖分子经浸泡后分子链中的β1,4糖苷键发生断裂而降解，且时间越长，断裂程度越大。此外，壳聚糖经生理盐水浸泡后，乙酰氨基吸收峰（1 704.32 cm-1）强度明显减弱，至30 d完全消失，120 d也无该吸收峰，同时氨基吸收峰强度（1 633.97 cm-1）随时间有增强的趋势。表明，壳聚糖在生理盐水中浸泡后，脱乙酰度增加。 pH值 图4是CS降解液的pH值的变化情况。可以看出降解液pH总体呈上升趋势。降解前7 d上升速度快，之后变缓。壳聚糖是自然界存在的唯一的碱性多糖，降解后其pH值会升高。pH值的升高可能是壳聚糖降解产生的氨基葡萄糖分子或其齐聚物引起的。 氨基葡萄糖浓度 氨基葡萄糖浓度的测定采用改进的MorganElson法。按照此方法得到的标准曲线为：y = 0.6909x + 0.0298（y为吸光度，x为氨基葡萄糖浓度，mmol/L，R20.9876）。组成壳聚糖分子链的单体主要是氨基葡萄糖分子，壳聚糖降解的最终产物是氨基葡萄糖分子。因此，考察降解液中氨基葡萄糖的含量可以反应其降解速率。图5是降解液中氨基葡萄糖浓度随时间变化曲线。可以看出，壳聚糖降解液中氨基葡萄糖浓度随时间逐渐增大。降解前3 d，浓度迅速增大，之后上升趋势变缓。 图1 壳聚糖膜失重率(略) Fig.1 Weight loss rate of CS films 图2 壳聚糖膜分子量变化(略) Fig.2 Molecular weight change 图3 降解不同时间后壳聚糖膜的红外分析(略) Fig.3 FTIR analysis of CS films degraded for different time intervals a:0 d; b:1 d; c:7 d; d:30 d; e:120 d 内皮细胞增殖 本实验用MTT法研究内皮细胞增殖的情况。MTT（又称噻唑蓝），其化学名是3(4, 5二甲基噻唑2)2, 5二苯基四氮唑溴盐，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲瓒。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，形成均匀溶液，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其吸光度值（optical density, OD），OD值越高说明甲瓒结晶，以此间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，OD值与细胞数呈正比，OD值能反应细胞增殖的情况，且在培养4 d后内皮细胞处于对数生长期，其OD值最能反应细胞增殖情况。 图4 壳聚糖降解液pH值(略) Fig.4 pH value of CS degradation fluid 图5 壳聚糖降解液氨基葡萄糖浓度(略) Fig.5 GS concentration of CS degradation fluid 降解液的RGR 图6是壳聚糖降解液培养4 d后细胞的相对增殖率RGR，从图中可以直观地看出不同时间降解液对细胞增殖的影响情况。降解的前14 d，RGR值在97.08%123.33%之间，接近或略高于对照组，表明此间细胞增殖并未受到不良影响。而降解2190 d，RGR值均小于100，其中21 d和60 d分别为69.82%和75.39%，对细胞增殖有明显的抑制作用（P0.05）。但降解到120 d后，RGR值又突然升高到138.67%，150 d为111.76%，均显著高于对照 (P0.05)，对细胞增殖又有促进。 氨基葡萄糖的RGR 为了探明GS浓度对内皮细胞增殖的影响，本文用生理盐水配制不同浓度GS溶液处理内皮细胞，并以生理盐水作为阴性对照，计算和比较了不同浓度GS共培养4 d后内皮细胞的RGR值，结果如图7所示。可以看出，GS浓度从10 nmol/L上升至1 mmol/L时，RGR值均在96.90%104.17%之间，与对照组无显著差异。当浓度≥10 mmol/L RGR明显降低（分别为68.12%和66.51%），与对照组比较差异极其显著（P0.01）。以上结果表明，GS浓度小于10 mmol/L时，细胞增殖与GS浓度无关；当GS浓度≥10 mmol/L时，对细胞增殖有显著的抑制。 图6 与CS降解液共培养4 d后ECV304的RGR(略) Fig.6 RGR of ECV304 cultured in degradation fluid of CS for 4 d 图7 与不同浓度GS共培养4 d后ECV304的RGR(略) Fig.7 RGR of ECV304 cultured with different concentration fluid CS for 4 d 从壳聚糖膜降解液中氨基葡萄糖浓度的分析可知，CS膜降解液GS浓度为50 μmol/L0.37 mmol/L，此浓度范围均在10 μmol/L1 mmol/L内。但从降解液作用后的细胞反应看，细胞增殖受到了显著的影响。根据上述结果可以推测，在CS的降解产物中，影响内皮细胞行为的决定因素并不是GS单体，而可能是GS齐聚物或二者的协同作用。细胞反应受到抑制并不是在降解后期，而是在降解中期。这一结果提示，影响内皮细胞行为的主要因素不是降解产物简单的量的累计，而是降解产物中齐聚物片段的分子结构。 结论 本实验壳聚糖膜在生理盐水中的降解是壳聚糖分子链中β(1, 4) 糖苷键断裂引起的，最终产物为氨基葡萄糖，降解产物的累积使pH值升高，且降解缓慢，120 d失重率为19.48。不同时间降解产物中氨基葡萄糖浓度都在氨基葡萄糖单体促进内皮细胞增殖的范围内，但降解中期2190 d的降解产物对内皮细胞的增殖有明显抑制作用，实验表明在CS降解产物中影响内皮细胞行为的决定因素并不是GS单体，而可能是GS齐聚物或二者的协同作用。【参考文献】 1Chandy T, Sharma CP.Chitosanas a biomaterialJ. 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