维生素类药物

第九章维生素类药物的分析 维生素是维持人体正常代谢功能所必需的活性物质 不能在人体内合成 脂溶性VitA D E K等 水溶性VitC VitB族 B1 B2 B6 B12 烟酰胺 泛酸钙 叶酸 烟酸等 分类 第一节维生素A的分析 一 结构与性质 一 结构 1 维生素A的结构为具有共轭多烯醇侧链的环己烯 R H维生素A醇R COCH3维生素A醋酸酯 2 维生素A为全反式结构 二 性质 1 具紫外吸收最大吸收在325 328nm2 不稳定性易氧化变质 密封 凉暗处保存 充氮或加抗氧剂3 能与三氯化锑反应呈色4 溶解性易溶于三氯甲烷 乙醚等 二 鉴别 维生素A 三氯化锑 不稳定的蓝色 紫红色 反应条件 无水无醇 一 三氯化锑反应 Carr Price反应 维生素ACh P 2005 鉴别 取本品1滴 加三氯甲烷10ml振摇使溶解 取出2滴 加三氯甲烷2ml与25 三氯化锑的三氯甲烷溶液0 5ml 即显蓝色 渐变成紫红色 二 紫外吸收光谱法BP 2000 VitASol1 无水乙醇 盐酸 100 1 max326nm Sol1Sol2 去水维生素A max348 367 389nm332处有拐点 水浴加热30s 冷却 去水VitA VitA3 VitA USP 24 规定斑点颜色和Rf值显色剂磷钼酸 BP 2000 杂质对照品法显色剂三氯化锑 三 TLC 三 含量测定 一 紫外分光光度法 三点校正法 药典附录 1 生物效价 换算因数维生素A的含量是用生物效价 国际单位 IU g 表示 维生素A的国际单位规定 1IU 0 344 g维生素A醋酸酯 1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数为 第一法测定维生素A醋酸酯时 换算因素为1900 第二法测定维生素A醇时 换算因素为1830 1IU 0 300 g维生素A醇 本法是在三个波长处测得吸光度 根据校正公式计算吸光度A校正值后 再计算含量 故本法亦称 三点校正法 其原理主要基于以下两点 2 原理 1 杂质的无关吸收在310 340nm波长范围内几乎呈一条直线 且随波长的增大吸光度下降 2 物质对光的吸收具有加和性 即在某一样品的吸收曲线上 各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和 因而吸收曲线也是二者吸收曲线的叠加 3 三点波长的选择法 1 第1点 选择维生素A的最大吸收波长 即 1 2 第2点和第3点 在最大吸收波长的两侧各选一点 2和 3 等波长差法 在 1的左右各选一点为 2和 3 使 3 1 1一 2 中国药典第一法测定维生素A醋酸酯时 规定 1 328nm 2 316nm 3 340nm 等吸光度法 在 1的左右各选一点为 2和 3 使 中国药典第二法测定维生素A醇时 规定 1 325nm 2 310nm 3 334nm 4 测定法药典附录 1 第一法 适用于维生素A醋酸酯 选择最大吸收波长 取供试品适量 精密称定 加环己烷溶解制成每1ml中含9 15单位的溶液 照紫外 可见分光光度法 附录 A 测定其吸收峰的波长 并在300 316 328 340 360nm五个波长处分别测定吸光值 如果最大吸收波长不在326 329nm之间 则应采用第二法 皂化法 测定含量 如果最大吸收波长在326 329nm之间 则计算各波长下的吸光度与328nm波长下的吸光度的比值 即 将计算得到的五个吸光度比值分别与中国药典规定的吸光度比值相减 即得到五个差值 判断每个差值是否超过规定的 0 02 判断 max是否在326 329nm之间 改用第二法 求算Ai A328 并与规定值比较 规定值差值 判断法选择A值a 如果最大吸收波长在326 329nm之间 并计算得到的五个波长下的差值 均不超过 0 02时 则不用校正公式计算吸光度 而直接用在328nm波长处测得的吸收度A328代入公式中求出 b 如果最大吸收波长在326 329nm之间 但计算得到的波长下的差值 有一个或几个超过 0 02 这时应计算A328 校正 并计算f 并按下法判断 校正公式 A328 校正 3 52 2A328 A316 A340 判断差值是否超过规定值的 有一个以上超过 未超过 计算A328 校正 用A328计算 若所得的数值在 3 则仍不用校正公式计算吸收度 而直接用A328代入公式中求出 若所得的数值在 15 3 之间 则需用校正公式计算吸收度 即用A328 校正 代入公式中求出 若所得的数值小于 15 或大于 3 则不能用本法测定而应采用第二法 皂化法 测定含量 计算A328 校正 计算f值 最大吸收波长是否在326 329之间 是 否 是 计算吸光度比值及差值 是否超过 0 02 否 皂化 A328 亦称皂化法 适用于维生素A醇 溶剂 异丙醇 2 第二法等吸光度法 S 9 15单位 300nm310nm325nm334nm测吸光度 并测定吸收峰的波长 乙醇 KOH皂化 乙醚 异丙醇 Sol 判断 max是否在323 327nm之间 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算 是 否 判断A300 A325是否大于0 73 否 是 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算A325 校正 并计算f 最大吸收波长是否在323 327之间 否 是 是 否 计算A325 校正 计算f值 A300 A325是否超过0 73 皂化后柱分离 f值是否在 3 0 以内 是 以A325计算 否 以A325 校 计算 5 计算 1 判断法选择A 2 求 3 求效价 4 求标示量 6 注意事项 1 勿强烈振摇 避免乳化 2 仪器波长的校正 3 半暗室中快速测定 防止VitA被氧化 二 三氯化锑比色法 在 max 618 620nm 处 测定吸光度 标准曲线法定量 第二节维生素B1的分析 一 结构与性质 一 结构 1 维生素B1 盐酸硫胺 是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵化合物 2 噻唑环上季铵及嘧啶环上的氨基为两个碱性基团 可与酸成盐 二 性质 1 溶解性2 具有紫外吸收3 硫色素反应4 分子中含两个氮杂环 可与生物碱沉淀试剂反应生成组成恒定的沉淀 5 氯化物的反应 二 鉴别试验 维生素B1在碱性溶液中 可被铁氰化钾氧化生成硫色素 硫色素溶于正丁醇 或异丁醇等 中 显蓝色荧光 1 硫色素反应 维生素B1Ch P 2005 鉴别 1 取本品约5mg 加氢氧化钠试液2 5ml溶解后 加铁氰化钾试液0 5ml与正丁醇5ml 强力振摇2分钟 放置使分层 上面的醇层显强烈的蓝色荧光 加酸使成酸性 荧光即消失 再加碱使成碱性 荧光又显出 2 氯化物的反应Ch P 2005 4 硝酸铅反应 3 沉淀反应 三 含量测定 一 非水碱量法原料滴定前须加入醋酸汞试液 反应摩尔比为1 2 维生素B1Ch P 2005 取本品约0 15g 精密称定 置100ml具塞锥形瓶中 加冰醋酸20ml 微热溶解后 密塞 放冷至室温 加醋酸汞试液5ml 喹那啶红 亚甲蓝混合指示液2滴 用高氯酸滴定液 0 1mol L 滴定至溶液显天蓝色 振摇30秒不褪色 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml高氯酸滴定液 0 1mol L 相当于16 86mg的C12H17ClOS HCl 二 硅钨酸重量法1 原理维生素B1在酸性溶液中与硅钨酸作用生成组成恒定的沉淀 根据沉淀及供试品重量即可计算含量 2C12H17ClN4OS HCl SiO2 12WO3 26H2O C12H17ClN4OS 2 SiO2 12WO3 4H2O 2molVitB1 1mol 2 测定方法Ch P 1990 取本品约50mg 精密称定 加水50ml溶解后 加盐酸2ml 煮沸 立即滴加硅钨酸试液4ml 继续煮沸2分钟 用80 恒重的垂熔玻璃坩埚滤过 沉淀先用煮沸的盐酸溶液 1 2 20ml分次洗涤 再用水10ml洗涤1次 最后用丙酮洗涤2次 每次5ml 在80 干燥至恒重 精密称定 所得重量与0 1939相乘 即得 3 测定条件 1 取样量宜在50mg左右 2 在盐酸酸性下沉淀 颗粒较大 3 加热煮沸 搅拌下缓慢加入沉淀剂 得到易于过滤的沉淀 4 硅钨酸与维生素B1用量8 1 5 沉淀的洗涤 热盐酸 水 丙酮 6 沉淀80 干燥至恒重 沉淀含4个结晶水 换算因素为0 1939 4 特点优点 经典的重量分析法 专属性强 结果准确 不需特殊仪器和基准物质缺点 操作繁锁 费时 三 紫外分光光度法维生素B1片及注射液吸收系数法定量 维生素B1的紫外吸收随溶液的pH变化而变化 pH 2 max 246pH 7 max 232 233 255 可用差示分光光度法来消除背景及辅料的干扰 1 原理 激发波长365nm 发射波长435nm 对照法定量 四 硫色素荧光法 NaOH 铁氰化钾 异丁醇 NaOH 异丁醇 NaOH 铁氰化钾 异丁醇 NaOH 异丁醇 S d A b 对照液 供试液 2 方法及计算 优点 灵敏度高 代谢产物不干扰 适合临床体液分析 缺点 操作繁琐荧光受干扰因素多 3 特点 第三节维生素C 一 结构与性质 维生素C是一种不饱和的多羟基内酯化合物 1 结构与糖类相似 具糖的性质 2 分子中的二烯醇结构具极强的还原性 极易被氧化 常用作其他制剂的抗氧剂 3 一元有机弱酸 C3 OH酸性较强 pKa 4 17 4 分子中有两个手性碳原子 C4 C5 具旋光性 中 英 美 日四国药典收载的均为L 抗坏血酸 其活性最强 5 具紫外吸收 6 水解 内酯环 NaCO3 NaOH 二 鉴别 1 与硝酸银的反应Ch P 2005 2 与二氯靛酚钠试液的反应Ch P 2005 二氯靛酚的氧化型在酸性介质中为玫瑰红色 碱性介质中为蓝色 3 与其它氧化剂反应 维生素C戊糖 兰色糠醛 三氯醋酸 脱羧 水解 H2O 吡咯 50 C 4 糖类的反应 5 UV 6 IRCh P 2005 三 杂质检查 溶液的澄清度与颜色2 铁 铜离子的检查原子吸收分光光度法 三 含量测定 1 原理维生素C具有还原性 在醋酸酸性条件下 可被碘定量氧化 根据消耗碘滴定液的体积 即可计算维生素C的含量 反应摩尔比为1 1 一 碘量法 维生素CCh P 2005 取本品约0 2g 精密称定 加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解 加淀粉指示液1ml 立即用碘滴定液 0 05mol L 滴定 至溶液显蓝色并在30秒种内不褪 每1ml碘滴定液 0 05mol L 相当于8 806mg的C6H8O6 2 讨论 1 在酸性介质中维生素C受空气中氧的氧化作用减慢 因此操作中加入稀醋酸10ml 但仍需立即滴定 2 加新沸过的冷水也是为了减少水中溶解氧对测定的影响 测定时加丙酮2ml作掩蔽剂 以消除抗氧剂亚硫酸氢钠的干扰 亚硫酸氢钠可和丙酮发生加成反应而被消除 3 维生素C注射液的含量测定 注射液 直接滴定法定量 二 2 6 二氯靛酚滴定法 原理 自身指示终点 三 HPLC 复合维生素制剂的含量测定 离子对反相HPLC法 离子对试剂采用甲醇和水都能溶解的樟脑磺酸 溶解样品时 加入二巯基丙烷磺酸钠 DMPS 作抗氧剂 保证样品的稳定 第四节维生素D的分析 维生素D2 骨化醇 麦角骨化醇 维生素D3 胆骨化醇 1 溶解性脂溶性 2 不稳定性含多个双健易被氧化 对酸不稳定 3 旋光性性状项下比旋度 一 结构与性质 4 显色反应 5 紫外吸收特征性状项下吸收系数 二 鉴别试验 一 显色反应 1 与醋酐 浓硫酸反应Ch P 2005 维生素D2Ch P 2005 鉴别 1 取本品约0 5mg 加三氯甲烷5ml溶解后 加醋酐0 3ml与硫酸0 1ml 振摇 初显黄色 渐变红色 迅即变为紫色 最后成绿色 维生素D3Ch P 2005 鉴别 1 取本品约0 5mg 加三氯甲烷5ml溶解后 加醋酐0 3ml与硫酸0 1ml振摇 初显黄色 渐变红色 迅即变为紫色 蓝绿色 最后变为绿色 2 与三氯化锑反应BP 3 其他显色反应 维生素D 三氯化锑 橙红色 粉红色 二 IRCh P 2005 维生素D2Ch P 2005 鉴别 2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱 光谱集452图 一致 三 维生素D2 D3的区别反应 维生素D与乙醇 硫酸反应维生素D2显红色 max在570nm维生素D3显黄色 max在495nm 三 维生素D2中麦角甾醇的检查 灵敏度法维生素D2Ch P 2005 检查 麦角甾醇取本品10mg 加90 乙醇2ml溶解后 加洋地黄皂苷溶液 取洋地黄皂苷20mg 加90 乙醇2ml 加热溶解制成 2ml 混合 放置18小时 不得发生浑浊或沉淀 四 含量测定HPLC药典附录维生素D测定法共有三法 第一法适用于无维生素A醇及其它杂质干扰时正相色谱 内标法 1 色谱条件色谱柱硅胶流动相正己烷 正戊醇 997 3 内标邻苯二甲酸二甲酯 2 系统适应性试验 目的获得待测成分及各种干扰成分色谱峰 检查分离度是否符合规定 3 计算校正因子 对照品为维生素D3 1 维生素D校正因子 f1 2 前维生素D折算成维生素D的校正因子 f2 4 计算含量 维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量 mi 单位 0 025 g 第二法