微生物-从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌.doc

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、 摘要 自然界中的绿色植物通过光合作用的最终产物为淀粉，当叶落时，可以被土壤中的微生物分解。这是微生物通过产生胞外淀粉酶而导致的结果。要从土壤之中分离产淀粉酶的芽孢杆菌，便可以通过在含有淀粉的培养基上培养，分离、纯化微生物，从而通过观察微生物消耗的淀粉而形成的淀粉水解圈，加碘液后观察。而芽孢是微生物的一种休眠体，可以被染色，通过显微镜观察。通过以上过程便可分离出所需的微生物。二、 实验目的及要求1、通过自主性试验，了解掌握微生物分离、纯化的一般步骤。2、熟练掌握微生物分离的各种技术与方法，及实验过程中所要注意的一般事项。三、实验仪器设备试管（加入435mL水）5支 培养皿13个 移液管（1ML）5支 接种耙4个 玻璃棒若干 载玻片若干 酒精灯 接种针 搪瓷缸2个 灭菌箱 培养箱 无菌操作台 显微镜 电子秤 电磁炉牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3克 蛋白胨10克 Nacl 5克 琼脂15克 水1000mL pH 7.07.2 淀粉培养基：牛肉膏2克 蛋白胨10克 Nacl 5克 琼脂15克 水1000 mL 可溶性淀粉 5克 孔雀绿试剂 蒸馏水 95的酒精 结晶紫试剂 卢格氏试剂四、实验方案设计（一）实验原理 淀粉遇碘变蓝，所以当生长在平板上的单菌落若能产生胞外淀粉酶，分解培养基中的淀粉，则当菌落周围滴加卢格氏试剂时，由于淀粉被水解，则不会变蓝，而远离菌落的培养基上则会由于仍有淀粉而变蓝从而形成淀粉水解圈，以此来鉴定是否该微生物们能够产生淀粉酶。对于芽孢来说，由于芽孢不易染色，但是一旦染色布很不容易洗去的原理。用孔雀绿染色后，可是微生物变绿，水洗后，可以洗去微生物非芽孢成分的绿色，再用蕃红染色，可是细菌变红，从而清晰的观察微生物的形状和是否产生芽孢。（二）实验过程设计1、培养基的配制按以上配方配制牛肉膏蛋白胨培养基300mL，淀粉培养基200mL。方法：按配方称取药品放入加入少量水的搪瓷缸中，用玻璃棒搅匀，在电磁炉上加热，煮沸并维持沸腾，最后补足水，倒入锥形瓶内2、对所用仪器的包扎试管（加入435mL水）5支 培养皿13个 移液管（1ML）5支 接种耙4个 装有90mL的水并带有玻璃珠的锥形瓶进行包扎3、对以上的培养基、仪器进行灭菌4、微生物的培养（1）对灭菌后的培养皿底部贴上标签，标明培养基及名称和组别，在超净工作台中倒9个牛肉膏蛋白胨培养基和四个淀粉培养基，然后放置几分钟凝固，然后倒置，放在37的培养箱中培养24小时，观察是否有菌落生长，若无，则可以用;若有，则需重新配制培养基。（2）制备土壤悬液。将采集到的土壤样品在电子天平上称取10克加入装有45mL水并带有玻璃珠的锥形瓶之中，震荡，使土壤样品充分溶解，然后放在沸水浴中加热8分钟，然后等其冷却。把5支分别装有4.5ml水的试管分别编号1、2、3、4、5，用移液管吸取0.5mL的土壤悬液在无菌条件下加入试管1中，震荡，制成的是百分之一的溶液，然后再以此制成千分之一和万分之一的土壤悬液，分别编号2和3（3）涂布。用1mL的灭菌吸管吸取百分之一的稀释液0.2mL在无菌条件下接种到牛肉膏蛋白胨平板正中央，然后用接踵耙把悬液均匀涂在平板上，接种三个平板。再以此接种千分之一和万分之一的平板各三个，然后放在37条件下培养一天。（4）菌种检测一天后，把培养的微生物选取单菌落进行芽孢的孔雀绿染色，在显微镜下观察是否有芽孢才能在。把有芽孢的菌落在无菌条件下转接到淀粉培养基上。然后再37下培养一天，然后在长出的菌落边缘上加入卢格氏试剂，观察是否能够形成淀粉水解圈。如果能，则该菌落便是所分离的菌种。（三）实验观察点及观测指标第一次观测，培养基无菌检测放入培养基24小时后指标，只有不声张菌落的平板才能证明没有被污染，才能使用。第二次观测，从土壤悬液中接种到牛肉膏蛋白胨培养基中培养24小时之后 指标，挑取一些菌种做芽孢染色，选取那些有芽孢并且在显微镜下观察为杆状的细菌第三次观测，在找到芽孢杆菌后分别转接到淀粉培养基24小时后 指标，选取能够产生淀粉水解圈的菌种五、实验内容及步骤（一）实验调试步骤1、从土壤悬液中接种到平板上时，不清楚那个浓度的稀释液适合2、所选取的单菌落不能保证一定会是实验所要找的（二）解决方法1、进行多次稀释后，接种到多个平