环境中微生物的主要类群

第三章环境中微生物的主要类群,授课教员：曾惠讲师,军事预防医学院环境卫生学教研室2010年6月30日,2008级预防医学5年制本科,微生物的类群庞杂,目前已经知道的微生物约有10万种，分布在自然环境中。,农田上层15cm处微生物的数量,菌落数与空气清洁度的关系,人体微生态中微生物的含量,人体消化系统中微生物群体 (个/g),按细胞结构分类：原核细胞型微生物真核细胞型微生物非细胞型微生物按致病性分类：致病性微生物条件致病性微生物非致病性微生物,主要内容,概述 原核细胞型微生物 真核细胞型微生物 非细胞型微生物,（重点）,原核微生物与真核微生物在细胞结构上的根本区别,一、原核细胞型微生物,细菌 放线菌 鞘细菌 滑动细菌 蓝细菌,原核型微生物基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、质粒质粒控制细菌的某些遗传性状（有性生殖、细菌毒力、耐药性、代谢酶等）可能具有特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢和菌毛等。以简单二分裂法无性繁殖，仅需2030分钟,（一）细菌（Bacteria）,（2）环境中常见致病菌与条件致病菌 P23-24表3-1（3）环境中其他常见细菌 假单胞菌属黄杆菌属产碱杆菌属无色杆菌属微球菌属 乳杆菌属其它细菌,假单胞菌属（Pseudomonas）,革兰阴性杆菌，有鞭毛能运动在自然界分布广泛在低温下能很好生长，可引起冷藏食品的腐败变质。 能利用多种有机物（是迄今为止发现的自然界杂食性最强的微生物，能以80多种有毒有机物为碳源），故在自然界物质转化中起重要作用，常被作为污染物生物降解的筛选菌种。,（二）放线菌(Actinomycetes),介于细菌和真菌之间。分布广泛，尤其土壤中（土壤特有的泥腥味）。能产生大量多种抗生素（已经超过4000种）可分解多种有机物质（烃类、氰类、吡啶、纤维素等），在环境治理中具有潜在应用价值。 少数菌种对人类有致病作用，如星形偌卡菌引起肺部化脓性感染。链霉菌属、诺卡菌属、小单孢菌属,链霉菌属,最高等的放线菌，具有各种形态的孢子丝。近千种，大多生活在土壤中。链霉菌能分解多种有机质。产生抗生素菌株的主要来源。,诺卡菌属,部分可对人致病，我国主要是星形诺卡菌，经外环境侵入伤口或吸人肺部，引起有特殊症状的化脓性感染。在自然环境中将有机质转化，如烃类的降解、氰类的转化，在污水处理中起重要作用。,小单孢菌属,多分布于土壤及污泥中。分解有机质及产生抗生素。棘孢小单孢菌可产生庆大霉素。,（三）鞘细菌,单细胞连成的丝状体细菌，丝状体外包围一层由有机物或无机物组成的鞘套。丝状体不分枝或形成假分枝，靠游动孢子或不能游动的分生孢子行无性繁殖，常生存于淡水或海水中。主要有球衣菌和铁细菌属。,球衣菌,较强的分解有机物的能力，常生存于流动的、有机物污染的淡水中；活性污泥曝气池中常见菌种，数量过多时会引起污泥膨胀。,铁细菌属,能将低铁氧化为高铁。广泛存在于自然界，在铁素循环中占有重要位置。铁质水管腐蚀与堵塞常因环境中铁细菌活动引起。,（四）滑动细菌,不借鞭毛而靠菌体蠕动进行滑动的一类细菌。多为丝状体，也有杆状或球状。贝氏硫菌属，为丝状体，分布于淡水或海水中，能氧化H2S为硫，对自然界硫素循环起重要作用。噬纤维菌属呈杆状，两端略尖，细胞柔软，可滑行。具有很强的分解纤维素的能力。,为单细胞生物，呈球形或杆状。过去称为蓝藻或蓝绿藻（Blue-green algae）,近年根据其仅有原始核而将其列入原核微生物。光合型微生物，是生态系统的首要环节（第一个产氧的光合生物）。自然界分布广泛。营养要求简单。水质污染时，可过量繁殖，形成“水华”。常见属：微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属。,（五）蓝细菌 (Blue bacteria,Cyanobacteria),蓝藻门,微 囊 藻,界、门、纲、目、科、属、种,颤 藻,蓝藻门,鱼 腥 藻,蓝藻门,二、真核细胞型微生物,具有分化程度较高的真正的核，有核膜、核仁和染色体，胞浆内有完整的细胞器。真菌藻类（低等植物）原生动物 （低等动物）,（一）真菌（Fungus）,与原生生物的主要区别在于有较硬的细胞壁真菌按形态分为单细胞和多细胞两类。单细胞真菌为酵母菌和类酵母菌（yeast）。多细胞真菌又称霉菌(mold)。分布广泛，存在于各种环境和生物体内。卫生学效应：引起物质变质腐烂的主要原因发酵、制药、食品工业等中具有重要作用少数致病,霉菌常见代表属 曲霉属：广泛分布于谷物、土壤等上，分解有机质能力极强，可造成霉变。为酿造、食品、制药行业的重要菌属。青霉属：典型结构为帚状枝，产生单轮或多轮对称或不对称的扫帚状小梗，多呈蓝绿色。,（二）藻类（algae）,藻类是一大群低等植物，细胞分化比较低级(无跟茎叶花等)。广泛浮游于淡水及海水的上层，也称浮游生物或浮游植物（phytoplankton）。是水生生态系统的初级生产者，是水生食物链的关键环节。 含叶绿体，行光合作用，同时呈现不同的颜色。利用二氧化碳，对N、P需求多。,常见藻类 ：绿藻：因藻体中含叶绿素及少量叶黄素，细胞呈草绿色。小球藻富含蛋白质和脂肪，可大量培养作为饲料和食品 。硅藻：含有大量硅质和果胶质，硅藻死亡后，形成硅藻土，可作为过滤剂、绝缘剂等。 甲藻：淡水中的甲藻喜酸性环境，当水中富含腐殖酸时，常有甲藻存在；海洋“赤潮”常由甲藻大量增殖引起；甲藻产毒可积于贝体而使人体中毒。,夜光藻 藻体呈球形，透明，肉眼可见，腹面有一条凹沟，口位于沟中央，近口处长出一根极小的鞭毛和一条粗大的鞭毛，海生。细胞内原生质淡红色，大量密集时呈红色，受波涛振荡刺激以后放出荧光，是我国赤潮的主要藻类。,本种可产生麻痹性贝毒。,膝沟藻,日本水域该种赤潮引起鱼类大量死亡。是南海北部沿海主要的赤潮生物。,本种可产生腹泻性贝毒。,渤海、东海、香港和南沙群岛等水域有分布，形成赤潮的主要种类之一。,原甲藻,（三）原生动物,形态与构造 ：单细胞低等动物。卫生学意义：水中重要浮游生物。可吞食细菌，在污水处理中起一定作用。是活性污泥的主要成分。某些种类是病原体。环境中常见原生动物主要有鞭毛纲、肉足纲和纤毛纲。,鞭毛纲：具有一至多根鞭毛。多生活于有机质较多的污水。绿眼虫、波豆虫、滴虫等常见。,肉足纲：运动细胞器是鞭毛，运动器官是伪足，也是摄食细胞器,变形虫，生活在富有藻类、含氧量较高的水塘或沟渠中或潮湿土壤的表层。,纤毛纲：运动细胞器是纤毛，也是摄食细胞器。结构较复杂。包括游泳型和固着型。,环境中常见原生动物目前已知有15000种：鞭毛纲：运动细胞器是鞭毛，具有一至多根鞭毛。如绿眼虫、波豆虫、滴虫等。多生活在污水中。 纤毛纲：运动细胞器是纤毛。在活性污泥污水处理池中，常以原生动物的类群与比例作为污水净化的指标。一般情况下，普通单体钟虫与群体钟虫较多时，说明污泥爆气池运转正常。,三、非细胞型微生物,特征：不具有细胞结构，具有体积极小、结构简单、专性寄生、抵抗力特殊的特点。环境中的病毒 ：空气中：如流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、天花病毒、水痘病毒、风疹病毒、腺病毒等。水中：多为肠道病毒。土壤中：可吸附于颗粒内而延长存活时间。 食品中：主要是甲型传染性感染和胃肠炎。许多疾病与食用贝类有关。如1988年上海甲肝大流行。,四、环境中微生物的应用及研究前景,环境中的微生物种类繁多，人们发现并已利用的微生物屈指可数。发现、认识并利用有益微生物、控制有害的微生物成为未来微生物学发展的主要方向。空间技术等新技术发展，太空微生物学和极端微生物学成为新的研究热点。,极端微生物是依赖于一种或多种极端理化因子的极端生命形式，主要类群包括嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌、嗜碱菌、嗜酸菌及抗辐射菌。,第四章,卫生微生物研究和检测的方法,授课内容,卫生微生物学检测的特点及基本原则卫生指示微生物卫生微生物研究和检测的方法卫生微生物研究和检测方法的前景,（重点）,（重点）,一、卫生微生物检测的特点与基本原则,特点：检测对象：致病、非致病、条件致病微生物标本来源：人体、环境环境中致病微生物数量少，需要特异的检测方法，并且多依靠指示微生物,一、卫生微生物检测的特点与基本原则,特点原则样品的采集原则样品的运送原则实验室检验原则,1.样品必须要有代表性:采样量：满足检测要求（P37）采样部位：均匀采样或者有代表性的部位2.避免对样品的污染器材灭菌、无菌操作3.避免对样品中微生物的杀灭和抑制避免有毒物质的残留和高温影响4.对样品进行详细的标记,（一）样品的采集原则,尽快送检：一般3-4h内送检，减少细菌死亡和进一步繁殖带来的影响。注意保护待检的微生物：一定的温度加保护剂特殊微生物需要特殊培养基进行完善的样品交接必须有样品送检单，与实验室人员逐项核对后交接,（二）样品的运送原则,根据生物安全规定，妥善包装待运输标本高致病力禽流感标本，须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧；然后放入大小适合的塑料袋内密封；再放入专用运输箱内，放人冰块，以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料；所有容器必须印有生物危险标识。SARS病毒感染的样品，须进行三层以上的包装，采集后加无菌外包装，置于专用密闭盒内(金属或硬塑料材质) ，用具有吸水性和柔软的物质填充固定，置于专用运输箱内，由2人以上专人专车运送。,（二）样品的运送原则,（三）实验室检验原则,具有相应的实验室硬件设施微生物危害程度分级：“实验室生物安全通用要求”（GB19489-2004）将微生物危害程度分为4级。危害等级I：低个体危害，低群体危害。危害等级II：中等个体危害，有限群体危害。危害等级III：高个体危害，低群体危害。危害等级IV：高个体危害，高群体危害。,具有相应的实验室硬件设施生物安全防护水平分级及要求：BSL-1：对应危害等级I： P1实验室BSL-2：对应危害等级II： P2实验室BSL-3：对应危害等级III：P3实验室BSL-4：对应危害等级IV： P4实验室,BSL: biosafety level P: protection,（三）实验室检验原则,具有相应的实验室硬件设施：1级（P4实验室）：可检验危害性最严重的病原体（指实验室感染机会多，感染后病情严重，无特效治疗，可致死的微生物；或可能引起严重的流行、需动员大量的人力物力进行防疫的微生物），如天花病毒、HIV、SARS病毒等。2级（P3实验室）：可检验特殊危险致病菌（如果感染能引起重症并可能有致死后果的微生物，或本国原本没有的致病微生物），如霍乱菌。,（三）实验室检验原则,具有相应的实验室硬件设施：3级（P2实验室）：检验一般致病菌（基本不引起实验室感染；或感染了发病率非常小的微生物）。4级（P1实验室）：检验非致病菌（不致病或有致病性的无毒株）。,（三）实验室检验原则,具有合格的人员和标准检验方法人员要有资质，并经常接受培训细菌计数生化实验重现性模拟样品检出考核采用国家标准方法或公认方法（WHO、EPA等）加强实验室质量控制仪器、设备、试剂：定期检定和校准注意记录和核查：如GLP实验室报告规范：数据规范，完整签名盖章,实验室应有应急措施应对突发事件能力需做多种检验时，微生物优先恰当的样品处理与检验均质化后再稀释去除抑菌剂等,卫生微生物检测的基本原则,二、卫生检验中的指示微生物,指示微生物（indicator microorganism）：在卫生监测中，用以反映检品卫生状况及安全性的指示性微生物。设定指示微生物的原因微生物（包括致病和非致病的）种类繁多，不可能一一检测环境中致病微生物往往数量少，检测困难，需要用相对易于检测的微生物来间接反映,（一）指示微生物的选择,选择原则：数量大易于检出，方法简单具有一定代表性，其数量变化能反映样品卫生状况及安全性,（一）指示微生物的选择,指示微生物的种类：反映微生物综合污染：菌落总数反映微生物污染来源：粪便污染指示菌（大肠菌群）;空气污染指示菌（溶血性链球菌等）不得检出的致病微生物间接反映致病微生物：如反映肠道病毒的噬菌体等可以指示消毒效果：嗜热脂肪芽孢杆菌（压力蒸汽灭菌）；短小芽孢杆菌（电离辐射灭菌）；枯草杆菌黑色变种芽孢（环氧乙烷灭菌）,粪便污染指示菌的选择标准是人及温血动物肠道的正常菌群，且数量大。排出体外后，在外环境中的存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长。排出体外以后，在外环境中不繁殖。,粪便污染指示菌的选择标准在被人或动物粪便污染的样品中易检出，而未被粪便污染的样品中无此种菌存在。用作饮用水指示菌，对常用饮用水消毒剂(如氯、臭氧)的抵抗力应该不低于或略强于肠道致病菌。检验方法简便，易于定量计数。,检测指示微生物反映样品安全性的原因,致病微生物种类繁多，检测方法亦多种多样，对样品的卫生安全性作出评价时，不可能分别检测各种微生物。分离、鉴定致病微生物需时长，不能满足实际工作的需要。,（一）指示微生物的选择,分离、鉴定致病微生物费用高，且对人员的技术要求也相对较高。由于致病微生物数量少，而检测方法的灵敏度不高或者受到检测量的限制，可能导致假阴性的结果。,检测指示微生物反映样品安全性的原因,（一）指示微生物的选择,（二）常用的指示微生物,菌落总数反映综合污染定义：单位量的被检样品 (g、ml、cm2、m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件培养后生成的全部菌落数量。表述：菌落总数（“细菌总数”不妥）， cfu/g、cfu/ml。意义：综合判定检样被微生物污染程度。方法：标准平板计数法、表面涂布法,（二）常用的指示微生物,粪便污染指示菌大肠菌群大肠杆菌粪链球菌产气夹膜梭菌,间接反映致病微生物存在的指示菌,大肠菌群,一群能在37、24h内发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌。主要有埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌及枸橼酸杆菌属。在37能生长的大肠菌群称为总大肠菌群；在44.5仍能生长的大肠菌群称为耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。,大肠菌群,来源于人、畜粪便，土壤、水体等外环境。检测方法简单，计数容易，菌群中包括的菌种类多，检出几率高，长期以来被广泛用作常规检测的卫生指示菌。如大肠菌群有检出，仍需要继续检测耐热大肠菌群。检测方法：多管发酵法、滤膜法和纸片法。,大肠杆菌,埃希大肠杆菌，是总大肠菌群以及耐热大肠菌群的主要细菌，作为粪便污染的指示菌最有意义。大肠杆菌的测定方法较为复杂。大肠杆菌数量与耐热大肠菌群具有很好的相关性。如大肠菌群有检出，仍需要继续检测耐热大肠菌群，如条件允许，最好进一步检测大肠杆菌。,粪链球菌,现归为肠球菌属，是人及动物肠道中的正常菌群，主要栖居于动物肠道内，数量较高；人粪中所占数量远少于大肠杆菌，每克粪便约含108个。大肠菌群与粪链球菌比值可区分人畜粪便来源：4.0，主要为人粪污染 0.7，主要为畜粪污染0.74.0，混合污染,产气荚膜梭菌,人和动物特别是食草动物肠道内的常住菌，数量远少于大肠杆菌，每克粪便为105106个。该菌能形成芽胞，对含氯消毒剂及外界不良环境有较强抵抗力，在外环境中存活时间较长。若产气荚膜梭菌被大量检出而大肠菌群数量很少时，则表示样品过去曾受过粪便污染，即陈旧性污染。,人类及温血动物肠道中寄居三类正常微生物大肠菌群：量最多，生存时间与肠道致病菌接近，抵抗力比致病菌强,，检出方法较易肠球菌：量中等，生存时间比肠道致病菌短，抵抗力比致病菌弱产气夹膜梭菌：量最少，生存时间比肠道致病菌长，抵抗力比致病菌强,不得检出的致病菌,（二）常用的指示微生物,肠道病毒的指示微生物大肠菌群不是水中病毒适宜的指示菌。理想的病毒指示微生物条件：检验方法简单操作安全抵抗力与肠道病毒相当或稍强在被人粪肠道病毒污染的环境中一定存在，其存在数量应等于或大于肠道病毒的数目。,（二）常用的指示微生物,大肠杆菌噬菌体f2；脊髓灰质炎病毒减毒疫苗株I。,三、卫生微生物研究和检测的方法,样品的处理 损伤菌的复苏 选择性增菌与分离 定量计数方法 分型鉴定的方法,混匀样品（非常重要）方法液体：电动混匀、手摇混匀、敲打混匀固体：搅碎混匀、研磨混匀、匀浆混匀目的保证检验结果的客观性和准确性。将样品充分破碎、混匀，有利于取样的代表性，而且可将样品内部的待测微生物释放，有利于培养鉴定。,（一）样品的处理,混匀样品（非常重要）样品浓缩方法沉淀法：借助离心力完成。过滤法：细菌被阻留在膜上。吸附沉淀法：细菌被共沉淀或被吸附。免疫磁珠法：用磁分离技术分离和浓缩微生物。,（一）样品的处理,环境样品微生物，在采样送检等过程中，受各种不利因素作用，可发生亚致死性损伤。用普通培养方法不容易培养。需预先进行复苏（resuscitation）或修复 (repair)才能培养。无选择压力的培养环境较低的培养温度,（二）损伤菌的复苏,目的菌检测的困难：少、与其他菌混合。选择方法：抑制其它微生物生长、促进目标微生物生长物理方法：厌氧条件培养厌氧菌、光照条件培养藻类等化学方法：根据微生物的营养需求，加入特制的促进或抑制生长的物质,Obligate Aerobes,（三）对目的菌的选择性增菌与分离,EMB (Eosin Methylene Blue，伊红亚甲基蓝)dyes inhibit Gram (+) bacteriaselects for Gram (-) bacteriaG.I. Tract infections caused by Gram (-) bacteria,计数,直接（显微镜下计数、比浊法）,间接（使菌繁殖）,倾注平板法表面涂布法MPN法（统计学方法）,“单个菌” 生长成“菌落”而计数,卫生微生物研究和检测的方法,（四）微生物定量计数法,倾注平板法准确稀释待测样品（一般10倍梯度），准确将稀释物定量（一般1ml）均匀地倾注到琼脂培养基中，培养后计数菌落。表面涂布法将样品定量（一般0.1ml）涂布在琼脂培养基的表面，培养后，计数表面生长的菌落数。,一个平板上生长的菌落数在30-300之间时最利于计数。,表面涂布计数法优点,可使用不透明培养基对细菌计数，如对营养要求高细菌，培养基中须加入血液而导致培养基不透明等。计数的菌落需再进行证实试验时，应使用表面涂布法，便于挑取菌落。可避免因倾注融化的热琼脂对待检菌的损伤。,最可能数法MPN法（最常用于大肠菌群计数）多次稀释直至最后的稀释度可能无菌，每个梯度均接种3个培养管，根据各梯度培养管中细菌生长情况，查表计算微生物MPN数（most probable number）,MPN/100ml=,阴性管总毫升数X所有管总毫升数,阳性管数X100,阳性管：产酸、产气,其它方法显微镜直接记数法、比浊记数法、计算机辅助自动记数、滤膜法等,（五）分型鉴定的方法（确定微生物的同源性）,血清学分型噬菌体分型细菌素分型耐药谱分型质粒图谱法,16s rRNA（PCR）法核酸杂交法G+C含量法基因芯片法蛋白质芯片法,基因组DNA的提取并进行纯度及浓度的测定 PCR扩增16S rRNA、纯化、产物的电泳检查及测序 登陆GeneBank登记并检索比较获得该菌株的种属,CGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCGGGATGCATGTTCTGGGGTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCGGCGATACGGGCAGACTCGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCCAACGCATTAAGCGCCCCGCC