HIV分子流行病学及其应用何翔

HIV分子流行病学及其应用,广东省疾病预防控制中心/广东省公共卫生研究院何 翔,分子流行病学,2,分子流行病学是一门采用分子生物学指标和技术手段来进行流行病学调查研究的科学，并涉及到多个新学科，包括生物信息学、分子生物学和数学(计算科学)就研究对象而言，传统意义上的流行病学主要研究宿主，而分子生物学方法主要研究病原体分子流行病学的早期定义中，包括无机分子和有机分子(如糖分子、蛋白质、抗体和核酸)，随着测序技术的快速发展，现在的分子流行病学更多的利用蛋白质和核酸信息随着测序技术的发展、计算能力的提高及新出现的病毒，分子流行病学的应用将更加广泛,HIV分子流行病学常用的方法,3,分子生物学技术与现场流行病学研究方法相结合基因序列分析异源双链泳动分析（HMA)单链构象多态性分析（SSCP）限制性片断长度多态性分析（RFLP)核酸探针杂交/特异性引物检测,HIV分子流行病学研究的主要内容,4,HIV的种类及分布HIV的起源和进化分子流行病学调查：地区HIV流行毒株的种类及人群/地域分布特征鉴定和研究新重组病毒的发生和传播研究影响不同地域流行HIV的流行病学因素HIV传播网络的追踪(传播链),进化分析的基本概念,5,HIV-1：人类最大遗传变异的病原体,6,迅速复制10.3x109 virions per day,高突变率1 substitution per genome per round重组7-30 crossovers per genome per round,高度相关但不一致病毒基因组: 准种(quasispecies),EVOLUTION/进化,灵长类动物的进化,系统进化树,Node 节点 包括内部节点和外部节点，外部节点又称为OTU (Operational Taxonomic Unit)，内部节点又称为HTU (Hypothetical Taxonomic Unit)Branch 分支 连接节点Cluster 簇 一组属于同一分支的分类单元如果具有单一起源，即称为簇Root 根 指的是进化树上最老的一个点或相信是距离分析的序列进化关系最远的一组序列 (outgroup rooting),Root 根,Node 节点,Branch 分支,Baldauf. 2003. TRENDS in Genetics, 19(6): 345-351,系统进化分析的验证瑞典HIV传播链,10,*maximum likelihood analysis under a GTR (general-time-reversible) nucleotide substitution model,PNAS USA, 93:10864, 1996,HIV的变异及分类,11,HIV 的分类：型、组、亚型和重组亚型,12,型别,亚型,组别,亚亚型,重组亚型,HIV,2,4,9,61, ,Gao et al., Nature, 1999Santiago et al., Science, 2002Corbet, J Virol, 2000Foley & Korber HIV Database,灵长类慢病毒的遗传多样性,HIV-1组别,14,(2009, Nature Medicine),HIV-1亚型, 亚亚型, 重组体,15,15,系统进化树分类的标准：亚型 vs 重组,16,16,系统进化树分类的标准: CRF,17,17,系统进化树分类的标准: URF,18,In East Africa, illustrated by this data from Kenya, URF form a substantial proportion of strains,18,HIV亚型及变异,19,HIV的起源及传入人群,20,HIV的起源：SIV的人畜共患感染（跨物种传播）,21,非人灵长类动物与人类之间发生跨物种传播的证据病毒基因结构的相似性Genetic similarity of viral genomes 进化关系的相近性Closeness of phylogenetic relationship 自然宿主的感染率Infection rates in natural host 地理分布的一致性Coincidence of geographical distribution 感染途径的可能性Plausible pathways of transmission,21,22,灵长类慢病毒的进化史,对HIV-1而言，至少发生了4次跨物种传播，形成了HIV-1的M组、N组、O组和P组；而HIV-2至少发生了3次跨物种传播,动物跨种传播从猿到人的证据,23,HIV-1 M 和 N 组起源于喀麦隆黑猩猩,24,提取RNA: 所有免疫印迹测定阳性; 31/34 env(390bp)和pol (890bp)RT-PCR扩增;,近期 感染,Science, 313:523, 2006,4/16全长序列分析,喀麦隆东南和中南栖息的黑猩猩分别是HIV-1 M组和N组病毒的来源SIVcpz是HIV-1的祖先,25,Science, 313:523, 2006,HIV-1 M 和 N 组起源于喀麦隆黑猩猩,HIV-1 O组可能起源于喀麦隆大猩猩,26,检测喀麦隆偏远原始森林区378黑猩猩和213大猩猩粪便标本抗体 40/323 P.t.troglodytes （+）；0/55 P.t.vellerosus（-）； 6/213 野生大猩猩（+）！HIV-1 gp41（重组免疫检测）， HIV-1 gp160/gp120，gp41和Pol （p66，p51）（WB）；,提取粪便RNA：所有抗体阳性大猩猩标本 RT-PCR：pol（890bp），env（390bp），env/nef（740bp） 系统树分析大猩猩病毒序列与HIV-1 O组非常拟合,Nature 444: 164, 2006,跨物种传播是如何发生的？,27,沿着商业/伐木道路的兽肉交易兽肉交易的副产品：宠物猴烟熏肉非人灵长类动物的兽肉,28,HIV-1 M组病毒进入人类的时间,Science 288: 1789-96, 2000 Nature 455: 661-4, 2008,提示HIV-1 M组病毒的共同祖先株存在于1930s,HIV-1: 来源于黑猩猩和大猩猩的免疫缺陷病毒,29,SIVcpz,Pan troglodytes,HIV-1,中部非洲人群,黑猩猩,至少发生四次独立的传播事件形成 了HIV-1 M, N, O，P组.,Gorilla gorilla,大猩猩,HIV-2: 来源于乌白眉猴的免疫缺陷病毒(SIVsm),30,乌白眉猴,关养的猕猴,西部非洲人群,艾滋病流行的起源和传播,31,HIV亚型的地域分布,32,32,HIV传播和流行,33,HIV-1 M组病毒是造成全球大流行的主要毒株，至今感染了约6000万人HIV-1 O组病毒感染了约10,000人N和P组病毒感染人数远少于M组和O组HIV-2主要分布于西部非洲，,全球HIV-1亚型分布,34,(AIDS 2011,25:679-689),我国HIV亚型分布（1996-2002年）,35,我国HIV-1 基因型的组成,在调查中检测到包括A，B，B，C，G，01_AE，02_AG，06_cpx，07_BC和08_BC在内的10种亚型和流行重组毒株；07_BC、01_AE、08_BC 和B毒株等4 种基因型是我国主要流行的HIV-1 毒株，占2006 年报告感染者人数的92.8%；存在6种gag和env基因片段不一致的毒株，其中部分毒株在不同省份检测到，可能已开始流行。,36,CRF07_BC,CRF08_BC,CRF01_AE,B,我国不同人群中HIV亚型分布,静脉吸毒和异性传播为2006年HIV感染者中最主要的传播途径，分别占报告HIV 感染者总数的50.4%和34.7%；其他传播途径包括血源相关传播（占3.8%，包括既往献血和输血）、男男同性恋（占2.1%）、母婴传播（占0.9%）、其他（占0.4%）和不详（占7.8%）。IDU人群中以07、08和01为主，分别占48.5%、23.6%和21.2%；异性传播中种类最多，包括检测到的12种基因型，01、07、08和B最多，分别占39.8%、21.9%、17.6%和11.6%；男男同性恋中以01_AE（55.8%）为主，超过以前调查中的欧美B（21.5%）；血源相关的感染者中以B为主，占92.5%。,37,我国HIV-1基因型的分布,38,我国主要HIV基因型的地理分布,39,小结,我国存在至少12种HIV-1基因型，其中四种为主要流行毒株病毒多样性在我国不同人群和地区中形成了不同的流行特征不同地区病毒多样性的差异导致病毒传播驱动模式的区别HIV基因型组成和感染者人群转变说明了我国HIV传播模式的变化未来我国HIV流行将呈现出更加复杂的状况与早期结果比较，本次调查检测到的HIV-1基因型种类、数量和分布地域均有所增加,40,我国主要的HIV基因型是如何起源、传播和流行的？,问题：,41,B的起源和传播,42,AIDS 2012, 26:877884,B毒株的流行,云南IDU流行的B毒株与既往献血员中流行的B毒株存在差别，形成2个不同的进化簇；既往献血员人群中流行的B毒株来源于云南，而云南B亚型来源于缅甸；目前在我国多数省份献血员人群中流行的B毒株已通过异性传播扩散到其他人群；云南地区B毒株的流行起始时间为1985年左右，我国中部地区献血员人群中HIV-1的流行起始时间为1989年。,43,AIDS 2012, 26:877884,B毒株在中国的传播,BTH 1983(1980-1985),BYN1985(1982-1987),BCN*1989(1987-1991),尚存的几个疑问：B是如何从泰国到达中国境内的？缅甸是否是其传播的一个环节？BYN毒株是否仅在云南德宏州出现，未在其他地方流行？即BYN和BCN*的边界问题。云南省内BCN*的起源及其与中部省份B的相互关系？各省之间传播的时序关系？各省不同人群间传播的时序关系？性传播在其中起到什么作用？,44,CRF01_AE的起源和传播,45,CRF01_AE的流行,我国至少存在7个独立的进化簇所有的CRF01_AE进化簇均于20世纪90年代中期从东南亚传入我国多个地区。,46,不同流行簇的地理分布,47,簇1、2和3主要在华南和西南省份的异性传播和静脉吸毒人群中流行簇4和5主要在北方的主要城市中的男男同性恋人群中流行簇6和7则分别在福建和云南的异性传播人群中流行,CRF01的传入与出境旅游可能有一定关联,48,CRF01_AE在中国的传播,CRF01_AE 1985,CRF01_AE1995s,一些想法：早期样本较少，造成CRF01_AE各流行簇如何形成的过程不清楚；目前的时间更多体现了各簇形成的时间，不排除传入时间更早的情况就目前的结果看，80年代中期即有少量CRF01_AE进入我国，只是到了90年代中期才随着性传播的快速流行形成各流行簇？是否可使用更短的序列研究起源？,49,Africa,CRF07_BC/CRF08_BC在中国的传播,50,J Virol 2008,82:9206-9215,CRF07_BC在亚洲的传播,51,J Virol 2008,82:9206-9215,CRF08_BC在亚洲的传播,52,J Virol 2008,82:9206-9215,小结,我国HIV的基因类型和流行模式的多样性越来越复杂B、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC毒株均存在多个进化簇的流行，其原因除了多个HIV病毒株从境外传入我国，例如多个CRF01_AE毒株几乎同时从东南亚传入我国，也包括某个HIV病毒在局部的特定人群中流行与快速传播，例如CRF08_BC在广西不同地区形成进化簇，而CRF07_BC和多个CRF01_AE毒株均在男男同性恋人群中形成单独的进化簇随着我国HIV感染者中通过性传播比例的持续增加，可以预期我国HIV流行毒株的种类和数量将进一步增加，病毒的流行特征也将更加趋于复杂。复杂的HIV流行状况将对我国的检测试剂研发、抗病毒治疗和与核酸检测相关的新技术研究和应用都带来巨大的挑战。,53,HIV传播途径的追踪(传播链),54,系统进化树分析已被证明是提供HIV-1传播史(链)证据的最有用的方法（流行病学目的和法律案件的分析）,分子流行病学在犯罪引起感染分析的中应用,55,美国加州拉斐特胃肠道医生，将来自于他的HIV感染病人的血液或血液制品注射给他的前女友；分析受害者和病人以及当地HIV-1感染者的HIV-1 RT和env序列；结论：受害者和病人的HIV-1 RT和env序列极其相近，二者的HIV-1RT序列中由AZT引起的耐药突变序列也非常一致；罪犯被判为二级谋杀罪。美国第一次在法院使用系统进化树分析由犯罪造成的HIV感染案例,PNAS 2002, 99: 14292-14297,gp120,RT,Minimum evolution bootstrap: 100 Parsimony bootstrap: 96%Bayesian posterior:100,100%,100%,病人 受害者 Lafayette 对照AZTR序列 0.00-1.45% 0.15-1.52% 2.61-6.75% AZTs序列 0.44-1.23% 1.60-2.61% 3.19-6.53%,56,3个MSM A, B, C HIV-1耐药株5年内传播链RT耐药突变位点继续稳定的传播在1个MSM中持续至少4年MSM C血液HIV序列与MSM B精液HIV序列更相似,91年感染，92年AZT 治疗，95年死亡,94年感染，97年与 C有性关系，D4T/3TC，RTV/SQV/d4T治疗,98年2-9月被B感染,确定传播方向：Washington Cases,57,pol,env,确定传播方向：Texas Cases,58,pol,env,CC01:02,03,04,06,07,CC01:02,03,04,05,06,07,序列信息与时间的相关分析,59,60,61,62,利比亚医务人员传播艾滋病毒事件,63,简单历史回顾,64,1998年3月：5名保加利亚护士和1名巴勒斯坦医生进入医院1998年：利比亚第二大城市班加西的法塔赫医院爆发 426名儿童因输血感染艾滋病，死亡50多人1999年：5名保加利亚护士和1名巴勒斯坦医生被指控涉嫌用利比亚儿童做实验品，导致这些儿童全部感染艾滋病病毒 2004年5月：当地法院判处涉案的6名医护人员死刑2006年：迫于西方压力，利比亚最高法院宣布重审 2006年12月6日：Nature 在线快速通道发表科学文章证明其无辜 2006年12月19日：利比亚最高法院维持原判2007年7月17日：利比亚最高司法委员会将死刑改判为终身监禁一周后，6名医护人员被引渡回国后获得赦免,64,流行病学证据,65,在2003年4月，在法庭的要求下，由2名国际HIV/AIDS科学家，Luc Montagnier和Vittorio Colizzi组成班加西事件研究组对在班加西市HIV-1爆发事件进行了科学调查。在提交的报告中他们提供了大量流行病学证据：在1997年以前该医院即收治过HIV感染儿童；在1999年6名外国医务人员离开后，该医院继续有3名儿童被感染；大量被感染儿童收治时间在1998年以前，且部分儿童到医院后的血清阳转时间少于1个月，说明感染时间可能在1997年甚至于更早。而分子流行病学的证据也表明，在该医院引起爆发的HIV病毒与1997年或1999年在该院传播的病毒极为相似，具有共同的起源；与非洲部分地区流行的HIV病毒株也很相似，推测该院爆发的HIV病毒来自于非洲亚撒哈拉地区。该报告结论：在该医院中存在乙肝和丙肝病毒很高的感染率，HIV病毒爆发更象是医院不规范的医疗活动造成，在6名国外医务人员到达以前，HIV-1和HCV已在该医院流行。,流行病学证据,66,HIV-1和HCV在1998年3月外国医生来到之 前在这家医院及其市郊已经流行44个 HIV-1 gag 基因序列和 61个HCV E1/E2基因序列，进行进化分析确定爆发传播史的真实时刻表使用所有与该医院传播毒株极其相似的参考序列和 使用贝叶斯方法和最大似然性方法估计和评价种系发生医院传播株序列在CRF02_AG簇中形成了一个非常完整的单元簇，表示医院爆发病毒来自于一个CRF02_AG种系该簇序列与3个西非参考序列接近，可以认为医院传播株是从西非传入利比亚系统树分枝至医院传播株的长度非常典型，因此医院传播株不是异常的分歧进化病毒HIV-1自然传人利比亚，与流动人口有关,Nature 2006，444：658,66,分子流行病学证据证明六名医务工作者无辜,67,三个进化簇：11个HCV 4a亚型（埃及流行株）；22个HCV4型（喀麦隆流行株）； 24个HCV1a亚型全球流行株）,67,分子流行病学证据证明六名医务工作者无辜,68,该医院感染者中获得的4个不同病毒（包括1株HIV和3株HCV）流行史分析结果表明，这4株病毒传入该院的时间均在1998年3月以前，其传入该院时间在1998年3月1日以后的概率几乎为0。 HCV簇比HIV-1簇起始早，支持该医院存在医源性传播的结论并表明该医院存在长期的传染病控制问题在爆发中流行的HIV和HCV毒株在1998年3月以前已经扩散并流行，这表明在传染链中的多个病毒传播在外国医务人员到达以前就已出现,68,-传播途径-地理信息-人口迁移-不同分区-道路、距离等,序列信息与其他信息的相关性分析,70,Gene Flow of Avian Influenza Virus (AIV),AIV gene flow,Lam et al. Ecol. Lett. (2012),Gene Flow of Avian Influenza Virus (AIV),Virus movement inside the body/orgran of a patient,Salemi, et al. J.Virol. (2005),Frontal lobe,Temporal lobe,Spinal cord,Occipitallobe,Meninges,Iliac lymph node,Seminal vesicles,Brain,Lymphoid,Maximum likelihood tree of HIV-1 env sequences isolated from different brain and lymphoid tissues at different time points,Virus movement inside the body/orgran of a patient,追踪HIV-1B亚型病毒株在欧洲的流行： 使用系统进化发生地理学方法,研究对象：16个欧洲国家和以色列研究方法：用系统进化发生地理学方法，推断HIV-1 B亚型在 个国家的迁移史研究结果：欧洲大多数国家，HIV-1 B亚型病毒是多途径输 入，然后传播至该国家各地；而波兰大多数感染是 由于单点输入欧洲HIV-1传播有很大的差异: 希腊、葡萄牙、塞尔维亚、和西班牙是 HIV-1传出原地 ；奥地利、比利时、卢森堡、丹麦和德国是病毒迁移目的地；意大利、以色列、荷兰、挪威、瑞典、瑞士和英国具有病毒双向迁移特点； 波兰无法明确迁移途径；防治干预策略的重点人群：旅游者、旅