WB详细操作过程.doc

一、制胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干2、玻璃板干净后，对着与胶接触的面对其靠拢，整齐的夹到绿色架子里，再按照说明书，配制分离胶（分为两块的配制与一块的配制）， 其中PAGE（解冻现拿现用，聚丙酰胺（4度冰箱冷藏），在加入分离胶之前用水检验是否漏水3、用枪头，对好玻璃板的边缘打下去，注意快速不要漏出去，液面要平，根据插梳子的位置，加入到一定高度，最后在加满纯水覆盖其上，封胶4、静置40min,将分离胶上的水倒出，观察分离胶是否有较好的制作好5、配制浓缩胶（分为两块的配制与一块的配制），配制好后迅速的加入到玻璃板内，并插上梳子，静置30min6、结束后，将玻璃板取下，放入纯水的盒子里，放入到4度冰箱内备用二、提取蛋白1、取出六孔板，吸取原培养液丢弃，靠边加入PBS洗涤（500ml），轻晃，吸取废液丢弃，洗涤三次2、加入蛋白裂解液（视细胞数量而定） 加入裂解液之后，调小移液枪量程，反复摧打至培养皿底部全透明3、将产物吸入1.5ml的EP管，用震荡机振荡30s，冰浴10min，反复三次，取的两支EP管标注蛋白名字）4、振荡离心 13000转，4度，5min5、用移液枪取离心后的上清液至新取的EP管，1.5ml 2支，注意名称的对称6、放入80度冰箱储存三、蛋白定量测定1、准备工作：BCA工作液、蛋白标准液、96孔板、冰盒、提取的蛋白2、按照说明书计算所需BCA工作液的量，A液：B液=50：13、在孔板盖子上标记，加标准液（8个）与样品的标记，在本子上写好浓度梯度，对着位置加入标准液浓度0，1，2，4，8，12，16，20，之后在标准样品的孔内，用pbs加满到20微升4、加完标准液，在对应的孔里加样品20微升，最后将配好的BCA液加入到标准液和样品中各200微升，5、放在37度振荡培养箱内振荡孵育30分钟6、提前将酶标仪打开7、时间到了之后，去将孔板拿出放入酶标仪中测蛋白：步骤：sessionnewnextuse defaultnext finish设置波长（526）出仓file wizard设置孔板数no.of unknowsadd and close左上角results左下方右键点（report/export)把左侧中的data添加到右框点save to file 选择储存路径保存 出仓放板、入仓、开始8、若没有错误，则将剩余的蛋白根据比例1：4（ Loading buffer：蛋白）加入 Loading buffer9、孵育100度，5min，提前将电锅浴打开10、完成后放入-80度四：样品蛋白处理 准备：PBS，移液枪，1.5mlEP管 步骤：取出上样样品至1.5 ml离心管中，加入5SDS 上样缓冲液至终浓度为1。（上样总体积一般不超过15 l，加样孔的最大限度可加20 l样品。）上样前要将样品于电浴锅中煮5 min使蛋白变性。1、稀释样品：五、电泳准备：电泳液500ml （现配),蛋白胶，10微升移液枪与枪头，样品，maker,冰盒，电泳装置步骤：1、将SDSPAGE胶放入电泳槽中，加足够电泳液，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。（短玻板向内，长玻璃板面向外，对准电极：红色为正极、黑色的为负极）2、上样：用移液枪吸取样品，并且吸出的样品不要有气泡，将加样的枪头插至加样孔中缓慢加入样品，先加入marker,根据蛋白浓度计算在后面的孔中加入蛋白样品，在加入完样品之后，最后一个孔中加入marker3、将电泳盒盖上盖子，第一次设置 80V，跑30min，时间到之后观察蛋白印迹是否marker的金黄色的条带跑出之后，将电泳改为120V，跑1h30min4、在此时间内准备电转液 大烧杯中先倒300-400ml 去离子水，防止发热，烧杯裂开； 100ml 10电转液200 ml甲醇；去离子水定容到1000ml 六：转膜准备：电转液、镊子、滤纸、PVDF膜、电转装置，冰盒步骤：1、在加有转移液的盘里放入转膜样的夹子、一块海绵垫2、PVDF膜在甲醇中浸泡30s，小心将膜放入电转液中3、将夹子打开，根据情况将短玻璃拿开并保持水平，根据海绵垫的大小形状4、要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于海绵垫上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将PVDF膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。5、夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在盆里放冰将转移槽放进去。用60 V转移2 h或40 V转移3 h。6、转完后将膜用1丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用七、免疫反应 1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。（提前配备封闭液，2.5g的奶粉，50毫升的PBST 摇匀后放入到4度下摇床里备用）2、提前塑封口袋3、 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；取出备用的塑封口袋，加入抗体溶液，从封闭液中取出膜，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育12 h后，放入4度冰箱内过夜4、次日，将膜拿出放在冰上，在盒子里倒PBST备用，用镊子轻轻将膜夹出放入盒子中，在室温内摇床8min 5次5、在第三次摇床时准备二抗，从4度冰箱内拿出相应抗体备用，并拿出配二抗所用的25ml瓶子，准备移液枪和枪头，按1：5000的比例加入二抗和封闭液，如：加10ml的奶封闭液、2微升的二抗，配完后摇匀，并放在摇床上和膜一起摇动6、完成后将盒子内的水倒出，剩余的水用枪吸出，再用枪头加入二抗，每个5ml再用振荡培养箱内孵育40min7、拿出后，倒出二抗液体，加入PBST在室温内摇床8min 5次8、在第四次洗膜时，准备显影的东西：盘子、镊子、1000的移液枪、200微的移液枪、显影杯，并提前开显影的机器十 、化学发光，显影1、在4度里拿显影液，将黑和白两种试剂1：1等体积混合；各加1ml，将膜蛋