药物特殊毒性评价

药物的遗传毒性及评价,了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等， 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护 措施、保证受试者用药安全,毒理学,特殊毒性评价,一般毒性评价,急性毒性,长期毒性,目的,局部毒性,遗传毒性 致癌性 生殖毒性 依赖性,先天愚型,海豹肢畸形,突变（mutation）指生物体遗传物质发生急剧的遗传学变化，导致可遗传的表型变异，其表型变异为不可逆的，这种现象称为突变作用。 突变作用可视为DNA结构在任一水平上受到破坏，并由此改变了体细胞或生殖细胞中的遗传信息，DNA是大分子物质，它决定了生命现象的基本属性,第1节 药物致遗传损伤的类型,碱基的排列顺序决定着蛋白质肽链的长短及其氨基酸的顺序基因是DNA分子上最简单而已完整的功能单位，每一个基因产生一种功能产物，几乎所有的基因功能产物是多肽（蛋白质）一个基因在伸直的DNA链上约500-1000个碱基对,结果可造成细胞或机体的死亡、或细胞、机体结构形态或功能的改变,染色体畸变（chromosome aberration）基因突变（gene mutation）,（一）基因突变 定义：组成一个染色体的一个或几个基因发生变化，这种变化不能用光学显微镜直接观察到。,二、基因突变与染色体畸变,（一）自发突变与诱发突变自发突变-在自然状态下基因结构发生的改变，与生物适应环境变化的进化有关诱发突变-在外界因素影响下所产生的基因结构改变改变,一、基因突变,（二）碱基置换与移码突变（1）转换型突变：指DNA多核苷酸链上的碱基中，嘌呤互相取代或嘧啶互相取代所引起的突变。如：亚硝酸可引起这种突变（2）颠换型突变：只DNA多核苷酸链上的碱基中，嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突变。如：二乙基亚硝酸胺,一、基因突变,（二）碱基置换与移码突变（3）移码突变 定义：指DNA多核苷酸链上碱基序列中丢失一个或几个碱基，或插入一个或几个化合物分子，结果使突变位点以下的碱基序列发生变更，以致使三联密码转录和翻译时，发生较多遗传信息的改变。多环芳香烃类、等能引起插入性移码突变,一、基因突变,（三）同义突变、错义突变和无义突变,一、基因突变,（二）染色体畸变定义：一个或几个染色体结构或数目发生变化，用光学显微镜可以直接进行观察。1.染色体数目的畸变 突变细胞中，染色体可以成倍地发生变化，也可以不成倍的增减,二、染色体畸变,2.染色体结构的畸变 断裂是造成染色体结构变化的根本原因，根据断片不同的重接方式，形成以下四种畸变：（1）缺失（2）重复（3）倒位（4）易位,在诱变因素的作用下，染色体从长轴上断下一个片段,染色体的断片未与断裂端连接结果：失去一个片段及所携带的遗传密码,断片与同源染色体连接结果：使部分遗传密码重复出现,断片作180倒转后，再接到断端结果：所携带的遗传密码紊乱,两条非同源染色体同时断裂，两个断片交换位置后相接结果：所携带的遗传密码紊乱,二、染色体畸变,第二节 突变作用的分子机理,一、直接作用于DNA1.碱基类似物取代如：5-溴脱氧尿嘧啶核苷与胸腺嘧啶（T）相似2.烷化剂的影响一般认为，鸟嘌呤的N-7位置最易接受烷化剂给予的烷化基团，当N-7位受到烷化后，分子的内部电子和质子位置重新排列，鸟嘌呤由酮式异构体变为烯醇式异构体，引起碱基错误配对，最终产生转换型碱基置换,二、不以DNA为靶的间接诱变凡干扰有丝分裂的物质，不管是抑制纺锤体的功能，或扰乱染色体分离，称之为干扰剂1.秋水仙效应有丝分裂（细胞分裂完全抑制）秋水仙碱 长春新碱2对酶促过程的作用 对DNA合成和复制有关的酶系统作用也可间接影响遗传物质,第3节 药物致遗传损伤的影响因素及后果,对人类基因库的影响,人类基因库是指人群生殖细胞所具有的能传给下一代的全部基因总和。基因组是指单一个体所具有全部基因在人群中每个个体新携带的有害基因的平均水平叫做人群的遗传负荷（Genntic load）或突变负荷（mutation load),体细胞突变的后果体细胞突变的后果中令人最关心的是致癌问题其次是致畸体细胞的突变可能与动脉硬化有关体细胞突变是老化的起因,突变后果,生殖细胞突变的后果 致死性的 非致死性的-遗传病（显性或隐性） 在遗传疾病增多的同时，突变的基因（及染色体） 损伤将造成下一代的基因库的遗传负荷,可遗传的突变都是坏事？,突变后果,符合下列情况者应优先考虑检测已知的或可疑的诱变剂有关的化合物在动物实验中表现出某些毒性反应的化合物临床疗程长，尤其是用于儿童和青年人的药物在大部分人群中使用的药物一般用于预防的药物普遍滥用的药物以高浓度与精子接触起作用的药物,第4节 药物遗传毒性评价,1 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 2 大肠杆菌回复突变试验 3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 4 微核试验 5 哺乳动物体内骨髓细胞遗传试验 6 哺乳动物体外细胞基因突变试验 7 果蝇隐性伴性致死试验 8 啮齿动物显性致死试验,第4节 药物遗传毒性评价国际经济合作发展组织（OECD）推荐方法,国际经济合作和发展组织（OECD）,鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验大肠杆菌回复突变试验微核试验哺乳动物体内骨髓细胞遗传试验哺乳动物体外细胞染色体畸变试验果蝇隐性伴性致死试验啮齿动物显性致死试验,测定基因点突变,染色体畸变,染色体畸变,生殖细胞染色体畸变,一些国家新药遗传毒性试验的项目,一、鼠伤寒沙门菌回复突变试验（ Ames试验）,1.原理 组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长成为菌落，通过计数菌落出现的数目估计药物诱变性的强弱。同时在检测系统中还包括大鼠肝微粒体酶（S9）体外代谢活化系统，使药物在体外受到与体内类似的氧化活化作用，因此可测出间接诱变原。,2.试验菌株,一、Ames试验,各种鼠伤寒沙门氏菌株对不同的致突变物敏感性不同TA100和TA98可推荐用于大多数致突变物和致癌物的检测。我国新药审批办法中推荐使用TA97、TA98 、TA100和TA102四种标准菌株。,一、Ames试验,试验前必须进行菌株的基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反应鉴定，合格后才能用于致突变试验,一、Ames试验,菌株鉴定基因型鉴定 A. 组氨酸需求试验 B. 深粗糙型(rfa)鉴定 C. urvB缺失的鉴定 D. R因子的鉴定(抗生素抗性试验)自发回变数测定对鉴别性致突变物的反应,一、Ames试验,（1）基因型鉴定组氨酸营养缺陷型鉴定（组氨酸需求试验）组氨酸营养缺陷型菌株只能在补充有组氨酸的培养皿上生长深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验）深粗糙型突变细菌，缺乏脂多糖屏障，一些大分子能进入菌体,菌株鉴定,一、Ames试验,uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验）uvrB缺失，即切除修复系统缺失R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄青霉素的特性,菌株鉴定,一、Ames试验,（2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程中，能产生自发回变（3）对鉴别性致突变物的反应经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不经体外代谢活化系统的自发回变数略高。,菌株鉴定,一、Ames试验,决定药物最高剂量的标准是药物对细菌的毒性和溶解度。西药最大剂量可达5mg/皿，中药可超过5mg/皿最低剂量0.2 g/皿.至少5个不同剂量每剂量间隔不差过5倍每个剂量应做3个皿可用水、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇做溶剂,一、Ames试验,3.试验设计,DMSO0.4 ml；乙醇0.1 ml,对照组阴性对照组阳性对照组对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行加S9与不加S9的对照,一、Ames试验,应用诱导剂处理后的S9进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9混合物平行条件下测试。,为何要制备S9 ？,为何要诱导制备S9 ？,代谢活化,一、Ames试验,S9代谢活化系统：经诱导的大鼠肝脏匀浆，离心后所上清即为S9上清液，再向其中加入一些辅助因子，如辅酶II（NADP）、6-磷酸葡萄糖、K+/Mg2+等，组成混合液，从而构成还原型辅酶II再生系统。肝S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多数化合物在体内经过其代谢。,一、Ames试验,(1)掺入法：(2)点试法：5.结果评价报告的试验结果应是2次独立实验的重复结果。判断是否是致突变物？,4.方法,一、Ames试验,（1）掺入法：Rt/ Rc=诱发回变菌落数/自发回变菌落数2为阳性(2)点试法：凡在滤纸周围长出一圈密集的回变菌落，该药物即为致突变物质。如在平皿上出现少数散在的自发菌落，则为阴性,一、Ames试验,二、 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,中国仓鼠肺（CHL）细胞（推荐）、卵巢（CHO）细胞原理具有遗传毒性的物质作用于靶细胞引起较大范围的DNA损伤，可出现染色体水平变化。制备中期分裂相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体数目和形态的改变。通过检测受试物诱发体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变能力，从而评价受试物的遗传毒性及其强度试验设计1.试验至少设4个剂量组2.最高剂量组的细胞存活率为10%-20%3.无毒性受试物最高剂量组不超过10mmol/L或5mg/ml4.应设空白对照、阳性对照和S9对照,用细胞遗传学方法检测受试物是否影响DNA结构或改变遗传信息的实验过程，从而判定受试物的遗传毒性,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,方法1.在培养72小时的细胞中一次加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液不足）及一定量不含血清的培养液，混匀后继续培养24h收获细胞2.收获细胞前加入秋水仙碱作用4小时3.用胰蛋白酶溶液消化并收集细胞，加入KCL溶液低渗处理10min4.离心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次5.常规底片，染色，清洗，晾干6.每组选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞进行染色体畸变分析,哺乳动物胞染色体畸变试验,结果及判定 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞和染色体结构，计算结构突变及多倍体出现率。 阳性结果判定标准：1 染色体畸变数增加与药物剂量有关，单剂量组按下表判定2 某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加,三、微核试验,原理 骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普通细胞核小，故称之为微核（micronucleus）。观察骨髓细胞中的微核率，有助于检验药物是否具有致突变作用。 虽然骨髓和外周血各种有核细胞中均可见到微核，但只有在无核的红细胞中才易辩认。在骨髓中无核红细胞有嗜多染红细胞（晚幼红细胞）和成熟红细胞两种，正常情况下，嗜多染红细胞占多数。由于毒性物质影响了骨髓红细胞尤其是嗜多染红细胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂片中一般均在嗜多染红细胞中进行观察。,微核试验,动物 NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半）， 。 给药剂量及途径 高、中、低三个剂量；高剂量以LD50/2为基准；低剂量应结合药效学及临床用量；一般单次给药。对照 阴性（溶媒）对照；阳性（环磷酰胺）。,环磷酰胺不同途径给药对小鼠微核出现率的影响,微核试验,试验设计1. NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半） 。 2.动物体重差异应在平均体重的20%之内。3.至少三个剂量组；高剂量以LD50/2为基准；低剂量应结合药效学及临床用量。4.设阳性对照组（环磷酰胺）和阴性对照组（溶剂）5.两次染毒或多次染毒,环磷酰胺不同途径给药对小鼠微核出现率的影响,方法 结果评价 微核检出率明显高于对照组，并有剂量反应