湖北省结核病防治研究所实验室诊断鲁进

结核病实验室诊断,湖北省结核病防治研究所周丽平2013年8月 鲁进上传，以供学习,结核分枝杆菌是结核病的致病因子与确诊依据，结核病实验室诊断就是用直接或间接的方法来证明患者体内存在结核分枝杆菌。在临床患者样本中寻找结核分枝杆菌也就是实验室检测的主要内容。理想的诊断技术应该具有快速、特异、敏感、准确简便和价格低廉的特点，这也是结核界近百年来技术研究的方向。,目前结核病实验室检查主要有：结核病的细菌学诊断（涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定）结核病的免疫学诊断（皮肤结核菌素试验、结核抗体测定、结核抗原测定、细胞因子检测）结核病分子生物学检测（DNA探针技术、PCR测序、PCR定性检测结核分枝杆菌、双重实时荧光PCR技术和TaqMan探针技术及等温扩增技术），目前分子生物学检测技术发展非常快。结核病病理学诊断。,根据国家和我省的“十二五”结核病防治规划，要求100的地（市）级结核病实验室具备药物敏感性试验能力、100的区（县）级实验室具备分枝杆菌培养能力，同时根据我省“三位一体”工作开展的实际情况 ，目前我省各级开展结核病诊断的实验室在涂片、培养、药敏实验方面能力还显不足。因此主要从细菌学诊断给大家做些介绍，同时简介目前我国正在评估和推广应用的新诊断技术。,抗酸菌涂片,涂片制备,每一张玻片都要编号涂抹痰标本自然干燥加热固定,使用铅笔在磨砂面上编号,使用竹木签进行涂抹,不得使用火焰加热的方法加速痰膜干燥,加热固定涂片,太厚 适宜 太薄,痰膜的厚薄,好,脱落,好,不均匀,适宜,太厚,太薄,涂片厚度,挑取了痰标本的脓性部分做螺旋状轨迹涂抹均匀 大小约为 2cm X 1cm 不要太厚 透过染色前的痰膜可以隐约看到报纸上的字,好的涂片,Ziehl-Neelsen 染色过程,初染 (碱性复红)脱色 (盐酸酒精)复染 (亚甲兰),抗酸菌,非抗酸菌,碱性复红,脱色,ZN 染色原理4,复染,染色过程,将涂片排放在染色架上滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，保持5分钟流水轻缓冲洗滴加脱色液，保持1分钟 流水轻缓冲洗滴加亚甲兰复染液，保持1分钟流水轻缓冲洗,将涂片排放在染色架上，注意间隔,滴加碱性复红,加热,流水冲洗,脱色-流水轻缓冲洗,复染,流水洗去复染液,在玻片架上自然干燥,涂片抗酸染色检查方法,ZN染色步骤,操作流程,涂痰膜自然干燥,复红加热初染5分钟,自然干燥镜检,流水冲洗,美兰复染30秒,5%盐酸酒精脱色1-3分钟,流水冲洗,流水冲洗,荧光染色,0.1%金胺“O”染液染色10分钟，水洗；3%的盐酸酒精脱色1-2分钟，直至无黄色可见，水洗；0.5%高锰酸钾溶液复染1-2分钟，水洗，晾干。检测用10倍目镜，40倍物镜，不加油。,显微镜读片检查及结果报告,单一的抗酸菌,“V”- 字形,成簇的抗酸菌,复染太浓造成的影响,适宜的复染,萋尼氏法镜检结果报告标准,阴性 未发现抗酸菌/ 300 视野报告实际菌落数 1-8 条 /300 视野(1+) 3-9 条 / 100 视野(2+) 1-9 条 / l 0 视野(3+) 1-9 条 / 每视野(4+) 达到或超过 10 条 /每视野报告1+至少观察300视野，2+至少观察100视野，3+以上至少50个视野,荧光法镜检结果报告标准,阴性 未发现抗酸菌/ 50视野报告实际菌落数 1-9条 /50 视野(1+) 10-49 条 / 50 视野(2+) 1-9 条 / 每视野(3+) 10-99条 / 每视野(4+) 达到或超过 100条 /每视野报告2+至少观察50视野，3+以上至少20个视野,分枝杆菌培养,操作步骤,对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约2ml痰标本置于相应的前处理管中；使用吸管，将与痰标本等体积4% NaOH加入前处理管中；旋紧处理管螺旋盖，接通涡旋振荡器电源，将处理管在涡旋振荡器上涡旋震荡30秒左右；如果以手持拿处理管，持拿方法是以拇指、无名指分别持拿处理管外壁，食指、中指按处理管螺旋盖。,操作步骤,将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置15分钟；拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取时吸取的程度要小于挤压的程度，使吸管前端一段不含液体，避免液体意外滴落。,操作步骤,保持培养基斜面水平或底端略高，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基使用接种2滴（约0.1 -0.15 ml），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部；将用过的吸管置于废液缸内；旋上培养管螺旋盖，不要太紧；轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。培养基置于恒温培养箱内，361孵育；,操作,痰标本,12倍4% NaOH,振荡匀化,静置,15分钟,37竖直培养8周,均匀接种0.1ml,2支/标本,斜面向上，37水平放置24小时,接种和孵育,培养流程图,涡旋振荡1-2分钟,痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH,分别接种0.1ml前处理液至2只培养基斜面,接种后3天、7天观察，此后每周观察一次,置37温箱培养,有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性,室温静置15分钟,4,3,2,5,6,7,1,登记与报告,接种后第3和7日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第八周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。无菌落生长 报告培养阴性菌落生长不及斜面面积1/4时 报告实际菌落数菌落占斜面面积 1/4 报告(1+)菌落占斜面面积1/2 报告(2+)菌落占斜面面积3/4 报告(3+)菌落布满培养基斜面 报告(4+),初步判定、报告,以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片显微镜检查、鉴定，根据涂片和鉴定结果进行报告。培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长时间，报告：罗氏培养抗酸菌阳性经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培养结核菌阳性,菌落形态,1、幼稚菌落比较小，表面光滑而有光泽呈黄色；成熟典型菌一般为中等大小或较大，干燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黄色，不透明凸起菌落。2、不典型菌落为细小、园形、湿润、易乳化、呈黄红色，一般7-10天内就成熟，常为非典型抗酸杆菌或非致病菌。,如果发现培养基污染，按污染面积报告污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/4 报告(C1+)污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/2 报告(C2+)污染菌有明显界限，且不超过斜面面积3/4 报告(C3+)污染菌没有明显界限或布满培养基斜面 报告(C4+),注意事项,留取标本后，尽可能立即进行培养。如果不能立即处理，应冷藏；将氢氧化钠分装成若干小瓶（小包装），每次使用新的氢氧化钠；如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作；在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处理阳性级别低的标本，最后处理涂片阳性级别高的标本打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再打开盖子,注意事项,处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生物安全柜内敞开所有的标本容器用过的无菌吸管应置于废液缸中；正确标记培养管避免标本之间混淆；控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢氧化钠到接种时间不能超过20分钟，为此，当标本数量较多时，应分批处理，每批标本数量不超过6份为宜；,注意事项,应将培养结果及时反馈给临床医生。7天以内的结果观察中如果发现污染，应告知病人及时收集另一份标本；如果发现快速生长分枝杆菌（7天内长出的菌落）。立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。结核菌可能在3-4周内生长。发现菌落并鉴定后立即报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满8周。登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培养物的菌落特征;污染结果应随时检出并报告。,常用的评价指标,涂阳培阴率=培养阴性的病例总数/涂片检查阳性的病例总数*100%涂阳培阴率应10%污染率=污染的培养管数量/培养管总数*100%污染率应5%,涂阳培阴率过高？,污染率过高？,药敏试验,目的：治疗，监测，诊断耐药主要就是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。,比例法 Canetti , 1963 临界药物浓度（单和多药物浓度） 临界菌群比耐药菌群数/全菌群数 1% 、10% 绝对浓度法 Meisnner， 1963 临界药物浓度（单或多药物浓度） 临界药物菌落数（10、20菌落）比率法 Mitchson， 1963 RR= MIC被检菌/MICH37Rv,常见几种法：,比例法药敏试验的基本步骤,含药培养基的制备菌液制备和稀释接种培养报告结果,WHO 推荐的DST培养基药物浓度 ( 2007),药敏实验,实验前物品准备所有实验用品必须无菌所有用品一次性拿入实验室，不要在实验过程中反复进出实验室,试验菌株的准备,一、临床标本初分离的菌株，若具备以下特点，可直接用于药敏试验： 1、出现肉眼可见菌落后12周的新鲜菌落。2、没有其他污染菌共存。3、涂片确认为抗酸菌二、以下情况需要二次传代后才能进行药敏试验：1、 固体培养基上生长老化的菌落。2、固体培养基上部分污染的菌落。,药敏实验,实验人员的安全防护：分枝杆菌药敏试验是对高致病性病原微生物的纯分离培养物进行操作，实验室实验人员进入药敏试验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、帽子、N95口罩。,菌悬液制备,准备磨菌瓶或磨菌管：磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。磨菌管为底部磨砂的玻璃管，带有与之匹配的磨砂玻璃棰（磨菌棒），分别高压后方可可使用。,菌悬液制备,磨菌瓶法： 在磨菌瓶中加入12滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋0.5-1分钟。加入少许灭菌的PBS或生理盐水。 将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或PBS其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即得到1mg/ml的菌液。,菌悬液制备,磨菌管法向磨菌管中加入1滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入少许灭菌PBS缓冲液或生理盐水，静止片刻，吸适量（1-2ml）至比浊管中，加入生理盐水直至其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即为1mg/ml的菌液。,取菌 磨菌,菌液稀释,每株菌事先准备好2个稀释管，然后用22 SWG标准接种环或微量吸管吸取比浊好的菌液，无菌操作逐步稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml。 22 SWG标准接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径3mm，1满环移液0.01ml。,接种及培养,用22 SWG标准接种环分别沾取1环 （即0.01ml ）10-2mg/ml和 10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结果。,取菌液,结果报告,按以下方式记录菌落生长情况：少于50个菌落： 实际菌落数50-100个菌落： 1+100-200个菌落： 2+大部分融合（200-500个菌落）： 3+融合（大于500个菌落）： 4+4周后观察结果，如果生长不良，可适当延长但不能超过6周报告结果. （耐药菌长的慢，药效丧失）,结果计算,计算耐药百分比： 含药培养基上生长的菌落数耐药百分比= - 100% 对照培养基上生长的菌落数若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,结果记录形式,菌浓度,药物,练习,药敏接种准备,质量控制,若高稀释度菌液（10-4mg/ml）在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株） 检测含药培养基的质量。,注意事项,培养基制备药物效价、保存与使用期限选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药敏试验，生长不良或陈旧菌株应传代后再进行试验比浊、菌液稀释应力求精确，以保证接种菌量的准确。下列操作应严格按技术规范进行，防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。实验后按要求处理废弃物和实验物品。,比例法药敏试验流程,对照培养基,含药培养基,药物储存液,混合、摇匀,基础液改良L-J,100ml,1ml,磨菌,分装凝固,分装凝固,1mg/ml菌悬液,10-4 mg/ml,10-2 mg/ml,100倍稀释,100倍稀释,接种0.01ml,接种0.01ml,2-3周新鲜菌落,冻存,分支杆菌的菌种鉴定（初筛）,根据分支杆菌在一些特定培养基上是否生长的特性，将其初步鉴定为人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌和非典型分支杆菌。主要的培养基为PNB（对硝基苯甲酸）、TCH（噻吩-2-羟酸肼）培养基接种方法：用22 SWG标准接种环沾取1环 10-1mg/ml的菌液（即0.01ml ），用划线法均匀接种至PNB、TCH培养基表面，每管最终接种菌量为10-3mg/管。接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结果。,结果判断,我国目前正在评估的新诊断技术,卫生部-盖茨基金会项目,我国目前正在评估的新诊断技术,卫生部-梅里埃基金会项目,我国目前正在评估的新诊断技术,卫生部-碧迪公司项目,涂片检查：LED荧光显微镜,发光二极管（LED）荧光显微镜光源寿命长（30,000h）不需要预热不需要暗室可用现有的显微镜可使用电池电源与通常荧光显微镜的判定一致率98.0%（n=1,326/内部资料）,Fraen FluoLED module,两种方法观察结果,Z-N染色镜检结果,LED镜检结果,中盖项目LED评估结果,初诊患者LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000）随访患者LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000）,中盖项目LED评估结果,读片时间LED 读片时间120.0338.88秒，明场显微镜206.3175.86秒（p=0.00）使用接受度调查对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使用,线性探针检测技术,可检测是否感染结核杆菌可同时检测患者是否对利福平和异烟肼耐药约五小时内即可得到检测结果,操作步骤,检测步骤DNA提取：11.5hPCR扩增：2.53h探针杂交：22.5h结果判读：0.5h,耐药分子诊断的基本原理,利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。,中盖项目线性探针检测利福平评价,中盖项目线性探针检测异烟肼评价,中盖项目线性探针检测MDR评价,结核耐药检测基因芯片,激光共焦扫描仪,软件判读,结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书,样品制备仪,杂交仪,通 量：两个一线抗结核药速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍）灵敏度：103 CFU/反应特异性：对照设计严谨；自动判读,基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）,96,获国家医疗器械证书和欧盟CE认证,基因芯片,基因芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,检测过程,芯片结果图例,芯片杂交质控,环介导等温扩增技术(LAMP),可同时检测患者是否感染结核对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备极其简单,PCR,LAMP,需要使用PCR扩增仪针对基因设计的特异性的两条引物扩增效率:107,不需要使用PCR扩增仪多对引物保证了扩增的特异性扩增效率:1010,扩增原理,操作流程,抽提基因组DNA,扩增管,去除杂质,将纯净DNA转入扩增管,样品处理在几分钟内就可以完成,Genexpert检测技术,可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单,基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测,Xpert TM MTB/Rif,技术平台利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析,自动化的标本处理和检测，可以在2小时内出结果h,干扰素释放试验,原理：分枝杆菌抗原致敏的T细胞体外再次