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小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间： 实验地点： 实验人： 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。2实验材料：1) 健康小鼠2) 手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3) 70%乙醇4) PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5) 0.2%台盼蓝6) 细胞计数板、计数器7) 离心机8) 显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏l 将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。l 用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。3.2制备单个核细胞悬液l 将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。l 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。l 弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为32410410=3.24107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。4.2白细胞计数在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题:起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。后来我们意识到，这可能是因为充池后立即观察，细胞还悬浮在液体中，和方格线不在同一个平面上。静置2分钟后再调焦观察，只能隐约看到方格线。在反复调试中发现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。另外，一定要注意在充池前对计数板的清洁。我们小组起初用卫生纸对计数板清洁，在镜下发现残留很多纸纤维，严重影响观察。改用擦镜纸清理后，就大大减少
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