肿瘤光动力学疗法与免疫效应分子.doc

肿瘤光动力学疗法与免疫效应分子肿瘤光动力学疗法与免疫效应分子本文来源：论文 /【摘要】 光动力学疗法（photodynamic therapy，pdt）是治疗肿瘤的有效手段，多种免疫效应分子在pdt介导的局部及全身反应中发挥重要作用。本文介绍了肿瘤pdt后主要免疫效应分子表达的改变和作用，以及相关肿瘤pdt增效的研究进展。 【关键词】 光动力学疗法；免疫效应分子；肿瘤 光动力学疗法(photodynamic therapy，pdt)以其微创、选择性作用、可反复实施等优点在恶性肿瘤及某些良性疾病的治疗中受到越来越多的关注，其抗肿瘤的作用机制主要包括光敏效应产生的单线态氧直接杀伤肿瘤细胞或诱导凋亡、损伤微血管及肿瘤间质、继发的抗肿瘤免疫反应1。本文对肿瘤pdt后主要免疫效应分子表达改变及发挥的作用、联合应用免疫效应分子的激活物或抑制剂对pdt的增效作用作一综述。 1 肿瘤pdt诱导的免疫效应分子变化及作用 1.1 细胞因子 1.1.1 白细胞介素（interleukin，il） 研究表明肿瘤pdt可诱导多种il表达改变，介导治疗后宿主的炎症及免疫反应。de vree等2发现荷横纹肌肉瘤大鼠经光敏素为光敏剂的pdt后，肿瘤生长延缓，伴有治疗后2 h血清il-1水平明显升高，424 h血液成熟中性粒细胞数量显著升高;应用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，g-csf）抗体，仅部分减少pdt引起的中性粒细胞升高，但肿瘤生长延缓时间明显缩短；认为il-1直接引起骨髓储存池中性粒细胞释放，并通过诱导g-csf刺激了中性粒细胞生成，g-csf又可增强中性粒细胞活性，发挥抑瘤作用。gollnick等3研究发现，小鼠emt6肿瘤光敏素-pdt后124 h，肿瘤组织中il-6 mrna含量升高，il-6蛋白表达也增加，治疗后24 h流式细胞分析示肿瘤组织中巨噬细胞百分比升高23倍，提示pdt可能通过上调il-6的表达，募集巨噬细胞至治疗部位，杀伤肿瘤细胞并介导特异性抗肿瘤免疫的建立；而pdt后肿瘤组织中il-10 mrna含量降低，减少了对th1型细胞应答的抑制。研究还发现小鼠emt6和colo26肿瘤光敏素-pdt后24 h，肿瘤引流淋巴结中表达il-12的抗原递呈细胞（antigen presenting cells，apcs）增加，分离这些apcs与t细胞共同培养，可刺激t细胞增殖并分泌-干扰素，说明pdt可激活apcs，通过分泌il-12诱导th1型反应，促进抗肿瘤细胞免疫4。yom等5对胸膜间皮瘤手术切除的患者联合应用术中foscan（meso-tetrakis m-hydroxyphenyl chlorin，m-thpc）-pdt治疗，发现单纯胸膜或肺切除术及联合pdt后，血清il-1、il-6、il-8、il-10水平均有升高，而且pdt后il-6升高明显，认为这些细胞因子介导了胸部手术联合pdt后的全身炎症反应。lai等6发现鼻咽癌患者pdt后，血清可溶性il-2受体明显降低，而il-2水平及nk细胞活性明显升高，表明pdt可通过升高血清il-2增强免疫效应。nseyo等7研究发现膀胱癌患者pdt后，尿液中可检测到il-1、il-2和tnf-，提示三者可能在pdt后的局部免疫中发挥作用。 1.1.2 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf) osiecka等8研究发现荷bfs1纤维肉瘤小鼠pdt后，血清vegf水平降低，肿瘤明显缩小甚至完全消退，治疗组荷瘤鼠生存期延长，认为pdt可降低血清促血管生成因子水平，影响肿瘤组织新生血管形成，抑制肿瘤生长。然而许多研究显示亚治疗剂量pdt或pdt后有残存肿瘤细胞时，可诱导vegf表达升高。deininger等9以竹红菌素作为光敏剂，应用4 mw/cm2功率密度的激光，照射人类ln229胶质瘤细胞系15 min（能量密度3.6 j/cm2），发现治疗后肿瘤细胞中出现大量包涵体，但无明显死亡征象，免疫印迹分析示内皮他丁等抗血管生成因子及vegf均被诱导分泌。uehara等10对小鼠nr-s1鳞状细胞癌进行能量密度约270 j/cm2（15 mj/cm2/脉冲，照射30 min，平均功率密度150 mw/cm2）的pdt治疗，光斑覆盖整个肿瘤，但治疗后周边区域仍有许多残存肿瘤细胞；免疫组化示pdt后06 h肿瘤组织中vegf表达明显升高，之后下降，24 h与对照组无明显差异，pdt后24 h肿瘤血管内皮细胞增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，pcna）表达明显降低，48 h恢复至对照水平；认为pdt可迅速引起肿瘤组织严重缺氧，诱导vegf升高，残存肿瘤细胞再氧化又使vegf表达下降，肿瘤氧供恢复后，血管内皮细胞在vegf作用下发生再增殖。togashi等11研究发现，人类nt-1口腔鳞状细胞癌经能量密度60 j/cm2的pdt治疗后，肿瘤组织中vegf表达情况与uehara等10的结果一致，但pdt后24、48、72 h，肿瘤细胞pcna的表达较对照组无明显变化，表明实验条件下，pdt对残存肿瘤细胞的增殖能力无明显影响。solban等12也发现能量密度为50 j/cm2的苯并卟啉衍生物-pdt后24 h，人类lncap前列腺癌细胞系及常位移植瘤中vegf明显升高，而p38 mapk抑制剂可抑制其升高，提示p38 mapk通路的激活可能与pdt诱导的vegf升高有关。临床pdt治疗中，由于激光穿透深度有限及肿瘤组织中光敏剂分布不均等因素，也难以完全杀灭肿瘤细胞，因此除注意给予足够的激光剂量、适时复照外，还可联合抗血管生成药物抑制vegf，以达到最佳抗瘤效应。 1.1.3 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，tnf） tnf具有抗肿瘤、调节免疫应答、介导炎症反应等生物学活性。evans等13研究发现应用光敏素敏化小鼠腹膜巨噬细胞后，予功率密度为0.3 mw/cm2的激光照射，可诱导tnf-分泌增多，照射45 min时（能量密度为7290 mj/cm2）tnf-升高达峰值，而延长照射时间至30 min，tnf-分泌完全消失，认为pdt后巨噬细胞产生的tnf可能直接杀伤肿瘤细胞，或通过影响微血管间接发挥抗瘤效应。coutier等14也发现人类u937巨噬细胞经能量密度为28 mj/cm2的foscan-pdt治疗后，吞噬活性显著激活，tnf-生成明显增多，对小鼠l929成纤维细胞瘤细胞系的杀伤作用增强，但随光剂量增加tnf-产生逐渐减少，能量密度为0.2 j/cm2时降至基线水平。上述两项研究均显示，亚致死光剂量pdt诱导巨噬细胞产生tnf-的反应更明显，这与临床pdt治疗中巨噬细胞可能受到的光辐照剂量近似。cecic等15应用抗体特异性阻断tnf-功能，抑制了pdt后2 h出现的中性粒细胞升高，提示tnf-参与pdt后早期中性粒细胞升高的诱导。 1.1.4 趋化因子（chemokine） gollnick等16 应用甲基嗜焦素烷基醚衍生物（2-1-hexyloxyethyl-2-devinyl pyropheophorbide-a，hpph）为光敏剂，对小鼠emt6肿瘤行pdt，发现治疗后424 h肿瘤组织中巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein 2，mip-2）水平明显升高；6 h肿瘤局部血管内皮黏附分子e-选择素表达显著增强，48 h恢复至治疗前水平；472 h浸润的中性粒细胞增多，应用抗体抑制mip-2或e-选择素活性后，肿瘤区中性粒细胞的聚集明显减少。这表明pdt可诱导趋化因子及黏附分子表达升高，引起治疗部位大量炎症细胞浸润；而入侵的炎症细胞可清除残存肿瘤细胞，并促进特异性抗肿瘤免疫的发展。 1.1.5 pdt后细胞因子变化的影响因素及肿瘤细胞和宿主细胞对细胞因子反应性的变化 肿瘤pdt后细胞因子的变化极其复杂，受多种因素影响，而且pdt也可引起肿瘤及宿主细胞对细胞因子的反应性发生变化，研究中应予以注意。du等17应用cne-2和hk1两种不同类型人类鼻咽癌细胞系及移植瘤研究发现，低分化、高表达il-6的cne-2细胞pdt后，il-6 mrna及蛋白水平明显升高，而高分化、低表达il-6的hk1细胞治疗后，il-6的转录和表达无变化；表明细胞类型、组织分化程度和细胞因子的基础表达可能影响pdt后细胞因子的变化。stat3是一种信号转导蛋白及转录蛋白活化因子，研究发现pdt可诱导残存肿瘤细胞中未激活的stat3特异性共价交联，使其不能转位至细胞核与dna结合，并衰减经细胞因子受体通路的信号转导，导致pdt后至少24 h细胞对il-6和抑瘤素m无反应，辅助肿瘤细胞逃避这些调节因子的抑制作用18。wong等19以光敏素和-氨基乙酰丙酸作为光敏剂，分别对几个上皮癌细胞系、正常上皮细胞和正常基质细胞进行pdt治疗，发现不同靶点pdt后，正常细胞和恶性细胞均失去对il-6和表皮生长因子的反应，恢复需4872 h，伴有细胞再增殖；认为pdt降低了正常细胞和肿瘤细胞对介导免疫反应及辅助组织修复细胞因子的反应性，改变了这些细胞的调节能力。 1.2 补体 补体是一组存在于血清、组织液和细胞膜表面具有酶活性的蛋白质,激活后可产生具有炎症介质作用的活性片段，并形成膜攻击复合体（membrane attack complex，mac），为pdt诱导炎症反应的启动和促进因素。小鼠emt6肿瘤pdt后30 min，免疫组化检测示肿瘤细胞和血管内皮细胞表面及胞质中大量mac沉积，表明pdt激活了补体系统15。cecic等20发现小鼠lewis肺癌经光敏素pdt后，肿瘤局部及血清中c3水平明显升高，治疗后2472 h补体活化的旁路途径激活，而阻断c3a或c5a受体肿瘤治愈率明显降低。研究显示小鼠fsar纤维肉瘤pdt后1 h，血液中性粒细胞明显增多，持续升高至24 h后下降，补体活性也于治疗后迅速升高，6 h升高2倍达峰值，24 h降至治疗前水平；pdt后中性粒细胞增多的时间范围与补体激活的时间动力学一致，提示补体级联激活反应产生的c3a和c5a与pdt诱导的中性粒细胞增多有关21。研究还发现荷fsar纤维肉瘤小鼠pdt后，血液中性粒细胞、单核细胞及b淋巴细胞c3a受体表达升高，未治疗的小鼠腹膜巨噬细胞和肥大细胞与pdt治疗的fsar细胞混合培养后，c3a受体也有所升高，而且特异性阻断c3a受体，可明显抑制pdt诱导的中性粒细胞增多，表明c3a可能是pdt诱导炎症和免疫反应中的关键效应分子22。 1.3 热休克蛋白（heat-shock protein，hsp） pdt引起的氧化应激可诱导hsp70的表达，gomer等23分别应用光敏素、单天门冬酰基二氢卟酚（mono-l-aspartyl chlorin-e 6，npe6）和红紫素衍生物snet2作为光敏剂，对小鼠rif-1肿瘤进行pdt治疗，反转录-pcr结果显示肿瘤中hsp70 mrna含量均升高。研究发现,hsp作为信号分子介导了pdt后补体编码基因转录上调。stott等24将小鼠肿瘤相关巨噬细胞与pdt治疗后的小鼠lewis肺癌细胞共同培养，发现c3、c5、c9 mrna水平升高，而应用抗体阻断hsp70后，c9基因转录完全抑制，c3、c5基因的转录也被明显抑制。研究显示pdt治疗后，小鼠sccvii肿瘤细胞表面hsp70、hsp60和糖调节蛋白94（glucose regulatory protein 94，grp94）的表达升高，hsp70分泌增加，pdt治疗后的sccvii细胞与巨噬细胞混合培养，可诱导巨噬细胞表面表达hsp70和grp94，并刺激其生成tnf-，应用抗体阻断hsp70功能，抑制了巨噬细胞tnf-的产生，提示hsp70可能参与pdt后炎症及免疫反应的调节25。 1.4 花生四烯酸代谢产物 外界刺激因素可激活磷脂酶a2(phospholipase a2，pla2)，代谢膜磷脂生成花生四烯酸，再通过环氧化酶(cycloxygenase，cox)和脂氧化酶(lypoxygenase，lox)途径，分别产生前列腺素(prostaglandin，pg)、血栓素（thromboxane，tx）和白细胞三烯(eukotriene，lt)等，发挥多种生理及病理作用。光氧化损伤可诱导生成大量花生四烯酸代谢产物，cecic等15对小鼠emt6肿瘤行光敏素-pdt治疗，发现阻断pge2、tx、lt、组胺、凝血因子以及il-1、il-6等功能，均可抑制pdt后血液中性粒细胞增多，认为这些促炎因子构成网络，共同调节pdt后炎症反应。研究发现pdt可引起血管内皮损伤、血栓形成，破坏微血管导致肿瘤坏死26，放射免疫检测示pdt后荷软骨肉瘤大鼠血清中tx水平迅速升高，pdt前3 h应用吲哚美辛，使tx释放明显减少，并完全抑制pdt后的微血管损伤和肿瘤消退，提示tx介导了pdt的血管效应27。hendrickx等28研究发现人类t4膀胱癌细胞系经金丝桃素-pdt后，胞质中钙离子浓度迅速升高，激活钙依赖性pla2，分解膜磷脂产生花生四烯酸，促进癌细胞凋亡；另一方面pla2又可激活p38 mapk-cox-2级联反应，诱导cox-2表达上调，代谢花生四烯酸生成pge2，刺激血管内皮细胞迁移，并抑制癌细胞凋亡。ferrario等29也发现光敏素-pdt（能量密度200 j/cm2，功率密度75 mw/cm2）后，小鼠rif肿瘤中cox-2表达上调，引起pge2合成及分泌增多，vegf表达升高;应用选择性cox-2抑制剂ns-398减少了pdt诱导的pge2和vegf，肿瘤治愈率提高。表明pdt后cox-2源性pgs可诱导肿瘤新生血管生成，促进肿瘤生长，而cox-2抑制剂通过抗血管生成作用增强了pdt疗效。 2 联合应用免疫效应分子的激活物或抑制剂对肿瘤pdt的增效作用 2.1 联合应用免疫效应分子或其激活物对肿瘤pdt的增效作用 pdt与许多免疫效应分子或其激活物联合应用，可增强疗效、减少治疗后复发。bellnier等30研究发现，pdt(1.5 mg/kg光敏素剂量)前2 h给予低剂量的tnf-诱导药物二甲基磺醌醋酸，较两者单独应用产生更为明显的肿瘤区坏死和血管数量减少，并可抑制肿瘤细胞再增殖，提高治愈率，但未增加正常组织的毒性。krosl等31应用基因转染技术制备了可持续生成粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, gm-csf）的小鼠sccvii肿瘤细胞，经50 gy x线照射后，分别于pdt前48 h、pdt后即刻及48 h 3次瘤周注射，明显提高了sccvii肿瘤的治愈率，这种gm-csf治疗对外周血白细胞数量无明显影响，但可增强肿瘤相关巨噬细胞的细胞毒活性。研究还显示,il-6基因转染的小鼠lewis肺癌细胞经npe6-pdt治疗后凋亡增加，提示pdt联合il-6治疗可能增强疗效32。联合应用补体激活剂也是改善pdt疗效的有效方法。korbelik等33研究发现小鼠lewis肺癌pdt治疗后，立即瘤内注射酵母多糖或静脉应用链激酶或尿激酶，可引起肿瘤组织中c3水平升高，mac沉积增多，明显降低肿瘤复发率。pdt后联合应用补体旁路途径激活剂-菊糖，显著提高了小鼠mca205纤维肉瘤中cd8+细胞毒性t细胞的比例，pdt高度抵抗性小鼠b16bl6黑色素瘤经上述治疗后，肿瘤复发时间延长3倍多，pdt前再加用小剂量-干扰素，可进一步延缓复发，个别肿瘤甚至治愈34。 2.2 抑制某些免疫效应分子对肿瘤pdt的增效作用 pdt也诱导某些负性免疫效应分子表达上调，gomer等35发现光敏素-pdt诱导了肿瘤微环境中vegf、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，mmp）和cox-2相关的pg表达增多，而靶向抑制这些血管生成和促生存因子，可改善pdt疗效。ferrario等36研究发现小鼠ba乳腺癌细胞系pdt后，联合应用选择性cox-2抑制剂塞来考昔和ns-398，使细胞凋亡增加；这种联合治疗未增加ba移植瘤的凋亡，但抑制了pdt后肿瘤组织中il-1、vegf、pge2及mmp-9等因子的升高，肿瘤复发率明显降低，提示cox-2抑制剂体外通过诱导凋亡、体内通过减少炎症及促血管生成因子增强pdt效应。makowski等37也发现小鼠c-26结肠腺癌细胞系pdt后cox-2表达增加，c-26移植瘤pdt后应用选择性cox-2抑制剂尼美舒利，明显抑制肿瘤生长，荷瘤鼠生存率提高。研究发现pdt前1 h及pdt后23 h，联合应用血管生成抑制剂im862或emap-，可抑制pdt后小鼠ba肿瘤中vegf升高；自pdt前1 h至pdt后第9天，每日腹腔注射im862或emap-可明显降低复发率38。尚有研究显示小鼠ba移植瘤pdt后，血管内皮细胞和肿瘤局部浸润的巨噬细胞mmp-9分泌增加，联合应用mmp抑制剂普啉司他，肿瘤治愈率显著提高39。 3 结 语 肿瘤pdt可引起多种免疫效应分子的变化，介导宿主局部及全身反应，影响pdt疗效。目前已在体外和动物实验水平进行了大量研究，但这一过程的分子机制、pdt后免疫效应分子间相互作用的网络、光敏剂种类和靶细胞类型对此过程的影响等问题，尚需进一步阐明，同时应加强临床研究进行验证。相信对pdt后免疫效应分子变化及作用的深入研究，将为优化临床pdt治疗提供有效方法。 【参考文献】 1王洪武. 现代肿瘤靶向治疗技术 m. 北京：中国医药科技出版社, 2005：50-55. 2de vree wj, essers mc, koster jf, et al. role of interleukin 1 and granulocyte colony-stimulating factor in photofrin-based photodynamic therapy of rat rhabdomyosarcoma tumors j. cancer res, 1997, 57 (13)：2555-2558. 3gollnick so, liu x, owczarczak 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