


全文预览已结束
下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
HPLC方案 3. 组织样品的处理3.1 组织样品处理从冰箱中取出肺、脑组织样,解冻,将组织先剪成几大片,剔除组织周围其他杂质成分如血块等,再剪碎,滤纸吸干。分别称取组织0.2g,按2.5ml.g-1组织加入生理盐水(0.5ml)制成组织匀浆液。在组织匀浆液中再加入萃取剂乙睛2ml,涡旋2min,3500转高速离心5min,定量吸取上清液2ml(尽可能吸多,但要求所有操作过程取出体积一致),50摄氏度下氮气流下吹干(即得已预处理过的组织干样)冰箱冷冻备用(以保鲜袋分组扎号,注意贴上标签)。测定时将上述组织干样解冻后,用100ul甲醇溶解,(注意盖上盖子,先转动试管使甲醇浸过吹干前液面)涡旋2min,12000转/分钟离心5min,得到供试液,取上清液20ul进样。(ug/ml)所取体积0.1ml空白组织质量0.2g)4. 测定方法建立4.1色谱条件(该条件要试验,保证内标与待测物峰充分分离,峰形好,出峰时间较短,最好控制在8min以内;可以先参考文献条件,再适当调整)CTO-20A色谱仪,流动相1%醋酸;检测波长350nm;流速1.0ml.min-1;柱温31摄氏度、;进样量20ul。4.2 方法专属性(看色谱图有没有干扰测试情况)空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织/血浆处理而得的供试液的色谱图;空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织+标准溶液处理而得的供试液的色谱图;(不需专门去做,取标准曲线中的某个色谱图即可);灌服低浓度药液实验鼠组织样供试液;(不需专门去做,取最后低浓度组测定中的某个色谱图即可);灌服高浓度药液实验鼠组织样供试液;(不需专门去做,取最后高浓度组测定中的某个色谱图即可)。4.3 标准曲线(血浆样品另外说明)试管分别加入0.04、0.1、0.25、0.5、1不同浓度标准溶液(各三份,此浓度适合样品测定,从测定样品结果判断,涵盖峰面积最大及最小的样品)各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管得到系列浓度含药组织(ug药/g组织),然后按照上述3.1处理,进样20ul,以峰面积A(三份平均)为纵坐标,浓度C(ug药/g组织)为横坐标,进行线性回归,求线性回归方程。相关系数要0.99,至少做五个不同浓度4.4精密度实验和准确度(方法回收率)试管分别加入低、中、高三个不同浓度标准溶液(此浓度分别为标准曲线的低限、中间、高限值,下同)100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,按照上述3.1处理,进样20ul,于1d内测完3份,求低、中、高3个浓度组织样的日内RSD值。另外分别于第二、三天再同法处理低、中、高浓度各一份,按照上述3.1处理,进样20ul,连同第一天数据,计算三天的低、中、高3个浓度的日间精密度RSD值。由测定的峰面积(五次平均)比,从标准曲线可以计算得到低、中、高三个浓度测定值C2,准确度表示为:测定值C2/标称值(配制值)(一般10010%为宜)4.5稳定性试验(1)反复冻融的稳定性:试管分别加入低、中、高浓度标准溶液100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织,标称值),在-20摄氏度条件下存放1d以上,测定时,将三份全部拿出解冻后,将其中一份按照上述3.1处理提取;另两份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后,将两份全部拿出解冻后,将其中一份按照上述3.1处理提取;另一份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后,拿出解冻后,将该份按照上述3.1处理提取;三份均进样20ul测定(各两针),计算反复冻融3个循环的稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(2)样品室温放置:取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织),室温放置4小时,然后按照前面提取方法提取、测定,计算室温放置的稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(3)萃取后放置的稳定性:按照上述制取低、中、高三个浓度的萃取液(复溶液),室温放置8小时,再测定,计算萃取后放置稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(4)组织样品- 20摄氏度冷冻2 周的稳定性:取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样,每个浓度平行3份,- 20摄氏度冷冻2 周,解冻后,按照前面提取方法提取、测定;计算稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。4.6提取(萃取)回收率试验(不需氮气吹干的提取回收率参考血浆样品)试管分别加入低、中、高值标准溶液浓度100ul,制成低、中、高3种浓度的质控溶液,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织),按照上述3.1处理,但此时上清液全部吸出,氮气吹干后,按照上述3.1处理,进样20ul,得面积A(三次平均)分别取上述低、中、高浓度标准溶液20ul直接进样三次,得峰面积B(三次平均),则提取(萃取)回收率=A/B100%5、样品测定(提取方法确定、色谱条件确定后可以先测样品再做方法的其它内容)以上述建立的方法、条件对样品测定,每个复溶液进两次,面积取均值(如果两次面积相差太大,要检查原因,考虑进第三针或重做)。根据峰面积,从标准曲线计算求出每克组织含药量。注意:1:保证整个过程的条件一致性,这是定量的基础。如,组织重量、内标量、匀浆时生理盐水量,提取甲醇量,第一次
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 榆社中学新建综合楼配楼项目可行性研究报告
- 修建火化场可行性研究报告
- 【完整版】2025年中国消防产品行业技术发展趋势研究报告
- 2025年中国健康体检服务行业分析报告-产业规模与运营规划研究
- 区队长考核管理办法
- 绿化人员考勤管理制度
- 考勤管理制度规章
- 会审会议管理制度
- 考勤管理制度名词
- 中学阶段学生行为规范体系构建与教育实践研究
- DL-T5434-2021电力建设工程监理规范
- 三病母婴阻断知识
- 眼科护士的职业发展与前景
- 新安江水电站科普知识讲座
- 《大学体育•击剑》课程教案
- 战伤处理原则和火线急救
- QC成果提高高强混凝土一次施工合格率
- 《遥感导论》全套课件
- DK7735型数控线切割机床使用说明书
- 新华街道统战工作八项制度
- GB/T 42448-2023系统与软件工程功能规模测量FiSMA1.1方法
评论
0/150
提交评论