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文档简介

HPLC方案 3. 组织样品的处理3.1 组织样品处理从冰箱中取出肺、脑组织样,解冻,将组织先剪成几大片,剔除组织周围其他杂质成分如血块等,再剪碎,滤纸吸干。分别称取组织0.2g,按2.5ml.g-1组织加入生理盐水(0.5ml)制成组织匀浆液。在组织匀浆液中再加入萃取剂乙睛2ml,涡旋2min,3500转高速离心5min,定量吸取上清液2ml(尽可能吸多,但要求所有操作过程取出体积一致),50摄氏度下氮气流下吹干(即得已预处理过的组织干样)冰箱冷冻备用(以保鲜袋分组扎号,注意贴上标签)。测定时将上述组织干样解冻后,用100ul甲醇溶解,(注意盖上盖子,先转动试管使甲醇浸过吹干前液面)涡旋2min,12000转/分钟离心5min,得到供试液,取上清液20ul进样。(ug/ml)所取体积0.1ml空白组织质量0.2g)4. 测定方法建立4.1色谱条件(该条件要试验,保证内标与待测物峰充分分离,峰形好,出峰时间较短,最好控制在8min以内;可以先参考文献条件,再适当调整)CTO-20A色谱仪,流动相1%醋酸;检测波长350nm;流速1.0ml.min-1;柱温31摄氏度、;进样量20ul。4.2 方法专属性(看色谱图有没有干扰测试情况)空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织/血浆处理而得的供试液的色谱图;空白(灌服0.5%羧甲基纤维素钠)实验鼠组织+标准溶液处理而得的供试液的色谱图;(不需专门去做,取标准曲线中的某个色谱图即可);灌服低浓度药液实验鼠组织样供试液;(不需专门去做,取最后低浓度组测定中的某个色谱图即可);灌服高浓度药液实验鼠组织样供试液;(不需专门去做,取最后高浓度组测定中的某个色谱图即可)。4.3 标准曲线(血浆样品另外说明)试管分别加入0.04、0.1、0.25、0.5、1不同浓度标准溶液(各三份,此浓度适合样品测定,从测定样品结果判断,涵盖峰面积最大及最小的样品)各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管得到系列浓度含药组织(ug药/g组织),然后按照上述3.1处理,进样20ul,以峰面积A(三份平均)为纵坐标,浓度C(ug药/g组织)为横坐标,进行线性回归,求线性回归方程。相关系数要0.99,至少做五个不同浓度4.4精密度实验和准确度(方法回收率)试管分别加入低、中、高三个不同浓度标准溶液(此浓度分别为标准曲线的低限、中间、高限值,下同)100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,按照上述3.1处理,进样20ul,于1d内测完3份,求低、中、高3个浓度组织样的日内RSD值。另外分别于第二、三天再同法处理低、中、高浓度各一份,按照上述3.1处理,进样20ul,连同第一天数据,计算三天的低、中、高3个浓度的日间精密度RSD值。由测定的峰面积(五次平均)比,从标准曲线可以计算得到低、中、高三个浓度测定值C2,准确度表示为:测定值C2/标称值(配制值)(一般10010%为宜)4.5稳定性试验(1)反复冻融的稳定性:试管分别加入低、中、高浓度标准溶液100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织,标称值),在-20摄氏度条件下存放1d以上,测定时,将三份全部拿出解冻后,将其中一份按照上述3.1处理提取;另两份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后,将两份全部拿出解冻后,将其中一份按照上述3.1处理提取;另一份放回冰柜在-20摄氏度冷冻一天后,拿出解冻后,将该份按照上述3.1处理提取;三份均进样20ul测定(各两针),计算反复冻融3个循环的稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(2)样品室温放置:取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织),室温放置4小时,然后按照前面提取方法提取、测定,计算室温放置的稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(3)萃取后放置的稳定性:按照上述制取低、中、高三个浓度的萃取液(复溶液),室温放置8小时,再测定,计算萃取后放置稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。(4)组织样品- 20摄氏度冷冻2 周的稳定性:取低、中、高三个浓度工作溶液各100ul,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样,每个浓度平行3份,- 20摄氏度冷冻2 周,解冻后,按照前面提取方法提取、测定;计算稳定性,以准确度表示(上述4.4),并计算相对标准偏差RSD。4.6提取(萃取)回收率试验(不需氮气吹干的提取回收率参考血浆样品)试管分别加入低、中、高值标准溶液浓度100ul,制成低、中、高3种浓度的质控溶液,氮吹挥干溶剂,称取大鼠空白组织(质量与含药组织相同),放入对应试管,每个浓度平行3份,制成3种浓度的质控样(ug药/g组织),按照上述3.1处理,但此时上清液全部吸出,氮气吹干后,按照上述3.1处理,进样20ul,得面积A(三次平均)分别取上述低、中、高浓度标准溶液20ul直接进样三次,得峰面积B(三次平均),则提取(萃取)回收率=A/B100%5、样品测定(提取方法确定、色谱条件确定后可以先测样品再做方法的其它内容)以上述建立的方法、条件对样品测定,每个复溶液进两次,面积取均值(如果两次面积相差太大,要检查原因,考虑进第三针或重做)。根据峰面积,从标准曲线计算求出每克组织含药量。注意:1:保证整个过程的条件一致性,这是定量的基础。如,组织重量、内标量、匀浆时生理盐水量,提取甲醇量,第一次

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