结核药敏试验价值

药敏试验在耐药结核病治疗中的价值和局限性,武汉市医疗救治中心吴文娟,医生期望的药敏试验,敏感=治疗有效,内容,药物敏感性测定的重要意义 临床治疗的重要参考 流行病学的重要指标,药物敏感性检测方法手工方法-（ 需要几周） 自动化方法 -Agar Proportion BACTEC 460 TB -L-J Proportion BACTEC MGIT-L-J Resistance Ratio BACT ALERT-Absolute Resistance BACTEC 960 MGIT - E- test TREK,药物敏感性试验常用标准方法绝对浓度法是由G. Meissner (德国) 于1964年首先提出的,是我国30 多年来一直沿用的药敏试验方法。比例法是由法国的G. Canetti 和J.Grossete于1963年首先提出,是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法。二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差别. 抗性比浊法是英国科学家D.A.Mitchison首先提出,由于方法比较烦琐,现已不多用,比例法和绝对浓度法的一致性比例法和绝对浓度法是测定分支杆菌药物敏感性的二种常规方法,前者是世界卫生组织(WHO) 在“全球结核病耐药监测项目”中推荐的统一方法,后者是我国各级实验室30 多年来普遍沿用的方法。近年来,随着我 国部分省陆续加入WHO 耐药监测项目,二种方法的一致性问题以及药敏试验是否向比例法转轨已成为国内争议的热点,比例法和绝对浓度法的一致性 综合以往国内有关比例法和绝对浓度法的试验报道，对2种方法研究结果显示,比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达6 %以上,对于结核分支杆菌,二种方法测试H、S、R 和E 的耐药率均无显著性差异。绝对浓度法向比例法转轨，将会使我们的药敏试验结果与国际接轨 ，与国际具有可比性，而不会影响到与我国既往资料的连续性和可比性,比例法和绝对浓度法的区别 (1) 绝对浓度法对接种量（ 10 3mg）要求十分严格,既要避免由于过量接种产生自然突变的可能,又要保证对照培养基上菌落生长旺盛,相比之下,比例法由于设定了高、低2 个（10-4 、10-6 mg ）接种量的参考系统,且试验结果的判定是通过计算活性单位的比值获得,因此对接种量这一药敏试验的重要变异因素进行了一定程度的校正,比例法和绝对浓度法的区别(2) 比例法定义1 %为“敏感”和“耐药”的临界点,而绝对浓度法规定低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20 个判断为耐药,按接种菌量的活菌单位计算与比例法的1 %耐药有相同的理论基础。在此基础上,由于绝对浓度法每种药物设定高、低2 个药物浓度,所以绝对浓度法在一定程度上反映了耐药的程度和水平。如果说比例法是定性的药敏试验,绝对浓度法则包含有“半定量试验”之意。（3）比例法操作较为繁琐，且需定量技术。,药敏试验基础培养基为无淀粉改良罗氏培养基，配方与酸性罗氏培养基相比只有磷酸二氢钾(KH 2 PO 4 )的量不同，其他成分完全相同。,抗结核药物溶液的配制和稀释 （略） 含药培养基制备 （略）药敏试验方法 （略）比例法药敏试验 （过程略）,药敏试验流程23周新鲜纯培养物磨菌制备mg/ml的菌液稀释至适当浓度接种适当菌量至含药培养基和对照斜面 37 培养4周报告结果,比例法药敏试验结果报告及解释按以下方式记录菌落生长情况. (1)少于50个菌落: 报实际菌落数(2)50100个菌落: 1+ (3)100200个菌落: 2+ (4)大部分融合(200500个菌落): 3+(5)融合(大于500个菌落): 4+,确定耐药临界点的机构,确定耐药临界点的机构WHOthe Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; formerly known as the NCCLS)美国临床实验室标准化协会 the European Union Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会,细菌耐药临界点的选择依据,药敏试验方法,耐药机制研究,临床实验数据,PK/PD,Monte Carlo 模型,PK/PD耐药临界点,Monte Carlo 模型耐药临界点(Monte Carlo Simulation Breakpoints)借助已 获得的药动学和药效学数据 ,结合当地细菌MIC资料，通过模拟大样本人群以及致病菌的不同MIC时的设定耐药的给药方案和药物浓度检测PK-PD参数所设定的临界点。已成为CLSI修改抗菌药物临界点的重要依据。,细菌耐药临界点的类型,微生物学的耐药临界点（Microbiological Breakpoint, Wild-type Cut-Off Value, Epidemiological Cut-Off Values）确定和验证抗结核药物耐药临界点的主要方法一线抗结核药物（除吡嗪酰胺）耐药临界点经过充分验证二线抗结核药物耐药临界点： Consensus-based critical concentration区分野生型细菌和获得性耐药的细菌,不代表细菌对治疗的反应,结果解释,耐药百分比计算：耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数*100%若耐药百分比1 %则认为受试菌对该抗结核药耐药,判读举例,耐药临界点的选择,药物耐药临界点：仅限于特定培养基和特定细菌L-J培养基报道的NTM“敏感”不代表真正敏感,利福平耐药利福布汀敏感存在吗？,影响药敏试验的价值的因素,细菌因素 耐药与敏感（抗结核药用前存在自然突变株）药敏试验的影响因素药物因素 药代学(Cmax, AUC, timeMIC) 药效学 (MIC, MBC, PAE) 药物特性 (透过血脑屏障的比例)机体因素 合并症 疾病程度和年龄(药物吸收不良) 感染部位,结核分枝杆菌药敏试验的价值和局限,药敏试验的影响因素,培养基 利福平对MTB的MIC 7H9培养基不含Tween 0.05-0.2 g/ml 7H9培养基含Tween 0.005-0.02 g/ml Ogawa培养基 10 g/ml LJ培养基 2.5-10 g/ml接种量：标准化问题 (接种量过多:假耐药 接种量过少:假敏感)培养时间 (培养时间 越长药物失效越多 ,固体培养基的MIC高于液体培养基的MIC)药敏试验的方法,结核分枝杆菌药敏试验的价值和局限性,药敏试验方法的局限性,在得到纯细菌的培养物后仍需4周报告结果，远滞后临床诊治的需要试验比较繁琐，结果受多种因素影响，可重复性较差实验室耐药与临床耐药之间有一定差距,“敏感”结核病疗效欠佳的原因分析,1 合并其它病原菌的感染（细菌、真菌）。,侵袭性肺曲菌病,2 、合并肺外结核,结核性脑膜炎、肝脾结核，结核性胸膜炎、骨结核、肾结核,3 将耐药结核病判断误判为“敏感”。,（1）Monte Carlo 模型评估耐药临界点,Gumbo T.New susceptibility breakpoints for first-line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability.Antimicrob Agents Chemother. 2010 Apr;54(4):1484-91.,2）野生型MIC分布法评估耐药临界点,4 、未发现低度耐药菌,四种方法：改良罗氏比例法，琼脂比例法，BACTEC，MGIT四种方法结果一致：2株敏感株（2/2），3株可能敏感株(3/3)，1株耐药株(1/6)和1株可能耐药株(1/8)目前的自动化肉汤培养基的方法（BACTEC460和MGIT960）容易遗漏低度耐药的利福平菌株,Van Deun A, et al. Mycobacterium tuberculosis strains with highly discordant rifampin susceptibility test results.J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3501-6.,5 、表型敏感，基因型有耐药突变,Williamson DA, Roberts SA, Bower JE, et al.Clinical failures associated with rpoB mutations in phenotypically occult multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2012 Feb;16(2):216-20.,6、 生理屏障,血脑屏障血-浆膜屏障血-骨屏障,分子量小,亲脂性,血浆蛋白结合率低,良好脑膜通透性,脑膜通透性,7 、药物在肺组织未能达到有效血药浓度和最佳效果,（1）合并糖尿病的肺结核患者利福平血药浓度下降（2）免疫功能下降（3）血管破坏（4）组织坏死、低氧、酸性环境影响药效(特别是氨基糖苷类和 喹诺酮类),Nijland HMJ, et al. Exposure to Rifampicin Is Strongly Reduced in Patients with Tuberculosis and Type 2 Diabetes. Clinical Infectious Diseases 2006; 43:84854,Nijland HMJ, et al. Exposure to Rifampicin Is Strongly Reduced in Patients with Tuberculosis and Type 2 Diabetes. Clinical Infectious Diseases 2006; 43:84854,耐药结核病的治疗策略,个体化治疗 标准化治疗,个体化治疗的局限性,The programmatic management of drug-resistant tuberculosis emergency update 2008. Geneva: World Health Organization; 2008. Available from:/publications/2008/9789241547581_eng.pdf （2008耐药结核规划管理紧急更新(版)日内瓦：世界卫生组织 ）Guideli