低温生物医学技术第二讲

低温生物医学技术第二讲,低温生物医学基本原理之一-溶液的冻结特性与细胞损伤,迄今为止，人们采用的低温保存方法，都是将细胞、组织置于含有抗冻剂的水溶液中进行降温、复温的，而在细胞内部也是富含多组分的水溶液。 因此，研究多元溶液的冻结、融化特性，以及他们可能对细胞产生的损伤是低温生物医学的重要任务之一。,2.1 水-冰相图,三相点,温度为273.16K,压力为610.62Pa(冰点?),1atm,冻结点是273.15K(冰点?)，这一段是冰水平衡线(给我们什么启示?降低冰点？),是冰和水蒸气平衡线(给我们什么启示?),2.2 纯水的冻结特性,a,b,c,d,e,样品温度,降温槽温度,降温曲线,a-b段：水以释放显热的方式降温；,b-c段：当过冷到b点时，冰晶形成，释放的潜热使样品的温度迅速回升到0；,c-d段：水在平衡条件下，继续析出冰晶，不断释放大量固化潜热。,d-e段：全部水被冻结后，固化的样品以较快速率降温。,特别指出：d-e段的降温速率可能远大于槽温的下降速度，因此在生物细胞的低温保存中，如何控制溶液固化后的冷却速率是热控制的一个重要问题和难点。讨论：怎么来控制？,2.3 过冷(supercooling)vs 成核(nucleation),冰晶的成核过程主要由热力学条件决定，而冰晶生长过程主要由动力学条件决定。,等温等压条件下固液两相体系的平衡条件是：,液相吉布斯函数,固相吉布斯函数,冰点,欲产生结晶的自发过程（即b到c），必须使液体过冷到某一低于Tf的温度Tc。,则有:过冷度形成冰晶的相变驱动力,过冷度越大，驱动力也越大！怎么实现较大过冷度？,成核理论,当水处于过冷态(亚稳态)时,可能以两种形式成核,即均匀成核(homogenous nucleation)和非均匀成核(heterogenous nucleation).,均匀成核,是指在一个体系内各处的成核几率相等,由于热起伏(或热涨落)可能使原子或分子一时聚集成为新相的集团(又称胚芽,embryos),若胚芽大于临界尺寸r*,则成为晶核。若液相分子热起伏聚集的冰相集团尺寸大于r*，则结冰过程为自发过程。,胚芽区,晶核区,r*,O,固相的形成能,固相尺寸r,过冷度（）,-30,-20,-10 0,0 40 80 120,晶核的临界尺寸r*（A）,当水的过冷度增加时，偏离平衡态的程度增加，冰晶核的临界尺寸和形成能就剧烈降低，这样就极大地提高了形成冰晶核的几率。怎样才能形成较大过冷度？,非均匀成核，又称异相成核，是指水在尘埃、容器表面及其它异相表面等处形成晶核。一般所要求的过冷度比均匀成核要小得多。,在实际样品冻结过程中，过冷点（通常与冻结点混淆）具有一定的随机性！那我们要怎么解决这个问题？,2.4 冰晶形成生长过程及其对细胞的影响,（一）降温速率的影响,慢速降温 形成晶核少，冰晶生长速率快，最终形成数目较少但体积较大的冰晶。快速降温 形成晶核多，冰晶生长受限制，最终形成数目多而体积小的冰晶。,（二）“置核（seeding）”的必要性,在实际降温过程中，水或溶液中可能出现较大过冷度；潜热释放完全后，可能出现很高的降温速率。这两种情况对细胞来讲都是不利的。因此，将事先浸入液氮中的细丝取出，并轻轻接触溶液表面，在极小的局部区域形成较大的过冷度，形成晶核。这有点像人工降雨中使用的降雨弹功能！,（三）无论何种结晶，冰晶的存在都会对细胞产生致命的损伤！,cooling,heating,-135,T(-90, -100, -110, -120,-130,-135),-82,25,10min,-5 /min,60 /min,The effects of final temperature of first cooling on inducing formation of nuclei（Yi Xu et al. Unpublished,2013）,Below -110C, there are small difference between Vs55 and Vs55+Fe; But they are very different at between -110C to -82C, which means Vs55 is more easy to form nuclei above -110C before devitrification. Why?,n=3,-135,T(-90),-82,25,10min,-5 /min,10 /min,Crystals may not be watched in time when using 60C/min. To make sure enough time to find the nucleus and clearly watch the subsequent crystals growing when passing through the devitrification region, 10C/min was used here.,-80C,-70C,-65C,VS55,VS55+Fe,复温过程冰晶的再生长的确存在,2.5 二元溶液的冻融特性,溶液的概念,两种或多种物质均匀混合且彼此呈分子状态分布。包括气、液、固三态。,二元溶液冻结曲线,F,A,B,E,273,D,TA,TB,TE,0,C,A,B,E,溶液,溶液+溶质,冻结溶液,冰+溶液,质量分数,温度T(K),如果初始浓度较大，且降温速率很高，溶液来不及析出冰，就会使全部溶液非晶态固化。若浓度过高呢？,（一）稀溶液的依数性质,拉乌尔定律（Raoults law） 溶液中水的蒸汽压降低值 等于纯水的蒸汽压 乘以溶质的摩尔分数 ，即,在相同外压下，稀溶液的沸点 要高于纯水的沸点 ，其升高值正比于溶液的质量摩尔浓度,*实际水溶液冰点降低的依数性质,实验证明，对于理想的稀溶液，其冰点的降低正比于溶液的质量摩尔浓度。,Tf=Tf0- TfTf0纯水的冰点Tf溶液的冻结点,这个结论可以解释什么？,（二）被冻结组织融化过程的特点,融化过程的作用是将已冻结的细胞、组织复温，力求使之恢复到原先未冻结前的状态。虽然它是冻结过程的反过程，但融化过程的热控制要比冻结过程更为困难？,冰的比热是水的一半，导热系数却是水的4倍，热扩散系数为8.6倍。,冻结过程：样品外层首先被冻结，继续通过这个冻结层进行吸热。融化过程：样品外层首先被融化，供热过程必须通过这个液体层。（可以将降温槽设定得很低，以提高降温速率，融化过程可以采用类似的处理方法吗？如何解决？）,细胞体积随渗透压的变化（冻结过程）,（三）冻融过程中的渗透现象,怎么评估细胞体积随渗透压的变化,进行无量纲化处理,1-骨髓细胞；2-酵母细胞；3-仓鼠细胞；4-红细胞（Mazur,1970）,2.6 细胞低温损伤的机理分析,此图的重要意义在于告诉人们，对于某一种细胞和某一确定的保存方案，确实存在着某种最佳冷却速率，对应最大的存活率，而过快或过慢的冷却速率都会导致细胞的损伤，降低存活率。,细胞低温损伤的两因素假说,存活率,冷却速率(Mazur,1972),胞内冰损伤,溶液损伤,总效果,胞外出现冰（胞外冰）；胞外溶液浓度增加；胞内水分及时向外渗透;细胞激烈收缩；胞内不出现冰（无胞内冰）。,冻结以前:,慢速冷却过程:（细胞小、膜渗透率高、降温慢）,水（多）,胞外溶液,胞内溶液,等渗,不等渗,胞外出现冰（胞外冰）；胞外溶液浓度增加；胞内水分来不及向外渗透;胞内溶液过冷;胞内出现冰（胞内冰）。,冻结以前:,快速冷却过程:（细胞大、膜渗透率低、降温快）,水(少),胞外溶液,胞内溶液,等渗,不等渗,2.7 关于两因素假说的深入研究,Leibo,用低温显微系统研究了鼠胚胎，用复杂细胞证实了Mazur的两因素理论。,慢速降温时，细胞逐步脱水收缩；快速降温时，细胞体积没有明显变化，单细胞内部变黑，这是因为胞内冰对光线的散射所致！,利用低温显微系统，定量研究了胞内冰形成和渗透过程中细胞体积的变化情况,A Microscope Diffusion Chamber For Determination Of The Equilibrium And Non-Equilibrium Osmotic Response Of Individual Cells, J. J. McGrathJ. Microscopy, 139, 249-263, 1985.,利用低温显微系统测量了细胞的水渗透率和迁移的活化能,华泽钊（1987）利用自行研制的低温显微系统，研究人体白细胞、肿瘤细胞、鱼胚胎时，观察到：过慢冷却时，细胞剧烈收缩，过快冷却时，出现了胞内冰。,2.8 冻结过程中的未冻水份额,当水溶液或生物样品被冷却至其初始冻结温度后，就不断有冰晶形成和生长。由于冰晶中成分几乎全是纯水，从而提高了未冻基质（unfrozen matrix,UFM）浓度，这种浓度的升高会严重影响生物样品中细胞进行低温冻存时的存活率。,获得未冻水的方法,对于生物样品中未冻水份额一般采用估算方法（利用稀溶液冰点降低性质）；也有采用一般扫描DSC方法测定（存在热事件滞后）；华泽钊采用低温显微图象分析法（与图像识别精度有关）；我们采用分布扫描DSC方法测定（Yi Xu et al,Cryo, 2007）。,H由DSC获得的焓差；x1血管干物质的质量分数；x2血管中DMSO的质量分数；Cp,art血管干物质的比热，取为1.23J/g.8；Cp,DMSODMSO的比热，取为1.97J/g.8；y某一温度T（初始冻结温度Tf）下冰晶的质量分数；Hlat某一温度下纯水冰相变潜热，J/g；Tf 初始冻结温度，；T 样品温度，。,2.9 复温过程中的细胞损伤,在许多情况下，细胞能在最佳冷却速率下降至低温，并长期保存在-196。但极有可能在复温过程中遭受损伤而死亡。？,原因,经冷冻后膜的渗透率发生变化，可能造成渗透率过大或过小，甚至完全没有渗透功能。渗透率未变，但复温过程发生细胞溶解。复温过程发生再结晶。,胞内冰的形成一定会对细胞产生致命的损伤吗？,Mackenzie（1970）将酵母细胞快速冷冻至-196，然后分批慢速复温至不同温度，再快速复温，分别测定细胞存活率。Bank(1970)将酵母细胞快速冷冻至-196，然后分批慢速复温至不同温度，再快速冷冻至-100 ，分别进行低温电镜观察再结晶情况。,结论：快速冷却过程中产生的胞内冰本身对细胞并非致命的损伤，但若在复温过程中速率过慢，使胞内冰再结晶，则对细胞的损伤是致命的；如果采取快速复温仍可能使细胞有教高存活率。复温速率越快越好吗？,2.10 造成损伤的其他因素,抗冻剂的种类、浓度及加入和取走的方式（保护剂毒性）过高的存储温度（再结晶）,下次讨论问题,