细胞工程实验-烟草叶片的组织培养.doc

细胞工程学实验报告专业：_ 09级生物技术一班_姓名：_ _学号：_ 09121007_ _实验一 实验室的设计及基本设备一、实验室的设计1、实验室设计的原因： 植物细胞工程实验室的流程是：清洗玻璃器皿、配制培养基、高压气灭菌、无菌操作、培养室培养植物、植物材料的检测。因此实验室需要有清洁器皿和配制培养基的准备室，无菌操作室或超净工作台，供培养材料用的培养室，检查培养情况并做记录的实验室。 一般在设计上，每个组分最好按工作的自然程序连续排列，如：准备室、灭菌室、无菌操作室、植物材料培养室、检测室。实验室的安排应合理简洁，并要求无尘、灭菌、光洁、清净。2、实验室的布局要求：（1）准备室 准备室可以是一大间或几小间，主要用于进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器脿醮涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。必要的设备有:准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。 洗涤灭菌区功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还 应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并 排水良好。 设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。（2）无菌室（接种室） 进行植物细胞、组织培养操作的关键是无菌条件。室内的墙壁要求光滑平整；地面为光洁的水磨石，平坦无缝，避免灰尘积累，便于清扫。紫外灯一般在3到4平方米内安装1到2只；在工作台下安置紫外灯紫外灯可使灭菌彻底。同时，工作台上方安装平板玻璃，以防操作时落灰。 条件不好时，用无菌箱代替无菌室，箱内用紫外灯灭菌。 功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。（3）培养室 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需 10-20平方米左右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应 配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。 室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高 17m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，日光灯一般用40W，固 定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的 需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。 5、缓冲间 功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。 进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。 缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。 二、实验室设备（一）常规设备 1、天平 组织培养实验室需要2-3台不同精度的天平。 感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。 感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。 2、冰箱 各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，一般普通冰箱即可。 3、酸度计 用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。 4、离心机 用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。 细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。 5、加热器 用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。 6、其它 纯水器、分装设备 （二）灭菌设备 维持相对得无菌环境是组织培养实验室的基本要求。 1、高压灭菌锅 用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。 2、干热消毒柜 用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200左右的普通或远红外消毒柜。 3、过滤灭菌器 用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。4、紫外灯 方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。 （三）无菌操作设备 1、接种箱 是使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。 2、净化工作台 其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。 （四）培养设备 培养设备是指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。 1、培养架 目前所有植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、可充分利用培养空间，以操作方便、最大限度利用培养空间为原则。一般有4-5层，层间间隔40-50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。 2、培养箱 细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。 3、摇床 进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。 4、生物反应器 进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。 （五）其他设备 可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。 四、培养容器与用具 培养容器指盛有培养基并提供培养物生长空间的无菌置，培养用具指培养物接种封口所用的各种金属或塑料制品，实验室必备。 （一）培养容器 包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。玻璃容器，一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。 （二）金属用具 1、镊子 植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，16-22cm长。 2、剪刀 不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，14-22cm。 3、解剖刀 组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。 4、其他用具 接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。 （三）塑料用具 各种风口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。 分数_ 教师_ 时间_实验二 实验前的准备一、器皿的清洗与包装l一般玻璃器皿(如锥形瓶、培养皿等)可用毛刷及去污粉或洗衣粉洗去灰尘、油垢、无机盐类等物质，然后用自来水冲洗干净。少数实验要求高的器皿，可先在洗液中浸泡数10min，再用自来水冲洗。最后用蒸馏水洗23次。以水在内壁能均匀分布成一薄层而不出现水珠，为油垢除尽的标准。洗刷干净的玻璃仪器160烘箱烘干备用。 2使用过的玻璃器皿的洗涤方法 试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。 玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。 装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2煤酚皂溶液（来苏尔）或025新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。 3新购置的玻璃器皿含有游离碱，一般先用2%盐酸或洗液浸泡数小时后，再用水冲洗干净。4、金属器皿的清洗 不宜用洗涤液清洗，一般用酒精擦拭，并且保持干燥。新用具因其有润滑油及防锈油涂护，用前要用含四氯化碳的布擦去油脂，再用湿布擦，烘干，消毒。5、包装 目的是防止消毒灭菌后再次污染，故在消毒处理前经过严格包装。清洗后先晾干再包装起来，才可消毒。包装材料一般用报纸（节省）。二、培养基的配制培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的10、20倍或100倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。Ms培养基的配方：1、大量元素(母液) gLNH4NO3 16.50KNO3 19.00CaCl22H2O 3.32MgSO47H2O 3.70KH2PO4 1.70几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。2、微量元素(母液) mg/LKI 83H3BO3 620MnSO44H2O 1560ZnSO47H2O 860Na2MoO42H2O 25CuSO45H2O 2.5CoCl26H2O 2.5几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。3、铁盐(母液)FeSO47H2O 556mgNa2-EDTA2H2O 746mg溶解后定容至100ml4、肌醇 1g溶解定容至100ml5、维生素（100x）烟酸 100mg盐酸吡哆醇(维生素B6) 100mg盐酸硫胺素(维生素B1) 20mg逐一溶解后定容至100ml6、激素的配制2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.2mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各20 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度0.2mg/mL的母液。Ms培养基的配制大量元素母液 100ml微量元素母液 10ml维生素 1ml肌醇 10ml铁盐 5ml蔗糖 30g琼脂粉 8gMS培养基配制培养液时的注意事项配制培养液时应注意： 在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； 用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次； 量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂8 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体沸腾五分钟。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。 需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.86.2)。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1 000 mL培养基，可分装2530瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。瓶口膜封盖瓶口，并用橡皮筋捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。 三、培养基及用具的高压灭菌：第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。 第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用瓶口膜封口)，用报纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。 第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。四、无菌室的消毒灭菌 地面和墙壁用洁尔灭（1:50）擦洗，接种的前一天晚上用过氧乙酸熏蒸灭菌，接种前20min把器材准备好后开紫外灯，。使用前用70%乙醇全面擦洗后方可使用。五、外植体的消毒灭菌植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。酒精 酒精是最常用的表面消毒剂，以70%75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。 酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。升汞,又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。 大豆先用75%的酒精浸泡3分钟，再加入升汞消毒17min，同时加入吐温80或吐温20.然后弃去消毒液用无菌水清洗45次，每次一分钟。注意：灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次污染。六、外植体的接种外植体的接种是把经过表面消毒后的植物材料切割或分离出器官、组织、细胞，转移到培养基上的过程。整个接种均需在无菌条件下进行操作，一切用具、材料、培养基、接种环境等都需要无菌。1、无菌操作规程无菌操作质量的高低决定了组织培养的成败，组培的工序中无菌操作的环节很多，材料切割、茎尖剥离、材料转接、封口等各个环节均要求规范、准确、迅速，任何一步做不好就会导致失败。2、材料的分割、切割和接种1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。接种好后，放入组培室培养，一般温度控制在25左右，光照12-16小时左右。图示：烟草叶片成功接种到培养基上由图片可以看出烟草叶片成功接种到培养基上后没有染菌生长正常实验结果：通过比较可以发现，将叶片接种到培养基上后，叶片的颜色由绿色渐渐的变成黄绿色，表明叶片在脱分化。叶片上出现褐斑，可能是是切烟叶时无菌刀太热所至，也可能原先叶片上生长不好的地方发育而来对实验没有太大的影响。 分数_ 教师_ 时间_实验三 愈伤组织的诱导一、实验目的 利用植物的快速无性繁殖技术诱导愈伤组织。二、实验原理 利用附加2,4-D 2mg/L的MS培养基上诱导愈伤组织。三、实验材料 烟草叶片四、实验步骤 1、培养基的配制、消毒及各种器皿的消毒灭菌。 2、接种室灭菌：打开紫外灯30min。 3、外植体的选取：取生长良好的烟草幼嫩叶片进行诱导。 4、操作台的消毒：进入接种室前关房间紫光灯，进入后关超净工作台上的紫光灯，用70%的酒精擦洗超净工作台3-4遍，将双手也用乙醇消毒。然后在无菌条件下将外植体接种到培养基表面。 5、实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。五、实验结果由烟草叶片成功诱导出的愈伤组织实验结果：烟草的愈伤组织形成、发育良好，没有染菌，所配培养基适合烟草形成愈伤组织。随着愈伤组织的生长，褐色区域也越明显，但对愈伤组织没有什么影响。愈伤组织的主体呈黄绿色但出现许多绿色的生长端点，这些端点经诱导可形成根或芽。 分数_ 教师_ 时间_实验四 芽的诱导一、实验目的： 了解植物快速无性繁殖技术。 选择适当的培养基诱导不定芽的产生二、实验原理 配制MS培养基并加入10ml6-BA，2.5mlNAA，作为诱导芽的培养基，用由烟草叶片诱导成功的愈伤组织诱导产生芽。三、实验步骤 1、实验前的准备：各种器具消毒、灭菌，培养基的配制及消毒，实验材料的选取。 2、接种室的消毒：接种前一天晚上用过氧乙酸熏蒸灭菌，第二天接种前20分钟打开紫光灯。 3、外植体的消毒：使用无菌苗。 4、进入接种室前关房间紫光灯，进入后关超净工作台上的紫光灯，用70%的酒精擦洗超净工作台3-4遍，将双手也用乙醇消毒。然后在无菌条件下将愈伤组织生长较好的部位切割下来接种到培养基表面，注意切口面向下。 5、将接种好的培养基置于培养室培养，定期观察记录结果。 6、实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。四、实验结果 由愈伤组织诱导生芽成功后的照片实验结果：接种后没有被细菌及霉菌污染生长状况良好，发出新芽并有明显的生长。由图片可以看出，培养基上方芽的生长不是很旺盛，而培养基下方的芽且生长的很旺盛，这是因为在接种幼嫩愈伤组织切块时，由于切块太小