热力灭菌工艺的微生物学验证.doc

热力灭菌工艺的微生物学验证注射剂无菌保证工艺研究及评价的原则要求注射剂无菌保证工艺是指为实现规定的无菌保证水平所采取的经过充分验证后的灭菌（无菌）生产工艺。目前，注射剂的无菌保证工艺主要有两种：1.终端灭菌工艺：在控制微生物污染量的基础上，在药品灌封后，通过湿热灭菌方式除菌。一般来说，本方法成本低，无菌保证水平高，适宜于大容量注射剂和小容量注射剂的灭菌。2.无菌生产工艺：在无菌系统环境下，通过除菌过滤法或无菌操作法，以防止污染为目的，消除导致污染的各种可能性来保证无菌水平。一般来说，由于本方法对环境系统的要求高，且影响无菌操作的因素多而使得无菌保证水平比终端灭菌工艺低。无菌生产工艺一般适宜于粉针剂，亦可适宜于临床需要但不能进行终端灭菌的小容量注射剂。由此，终端灭菌工艺和无菌生产工艺具有不同的系统要求、不同的除菌方法和不同的无菌保证结果。评价无菌保证工艺是否有效曾一度主要通过对终产品抽样进行无菌检验来判断；由于微生物在产品中的分布是不均匀的，且抽检样品的数量有限，故抽检的结果不能真实代表整批产品的无菌状态。国际上更为注重无菌保证工艺的设计是否合理、所用的设备与工艺是否经过充分的验证，在此基础上，切实按照验证后的工艺进行生产，这样才能保证灭菌（无菌）工艺的可靠性。在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺的效果，SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定，采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一；而采用无菌生产工艺的产品，其SAL一般只能达到10-3，故仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌的产品。无菌生产工艺只适用于粉针剂或部分小容量注射剂。一、注射剂剂型选择的原则从无菌保证水平的角度考虑，注射剂剂型选择的一般原则如下：1首先要考虑被选剂型可采用的灭菌工艺的无菌保证水平的高低。原则上首选剂型应能采用终端灭菌工艺（F08），以保证SAL10-6。2对于有充分的依据证明不适宜采用终端灭菌工艺（F08）且临床必需注射给药的品种，可考虑选择采用无菌生产工艺的剂型。通常无菌生产工艺仅限于粉针剂或部分小容量注射剂。二、无菌保证工艺的技术要求1大容量注射剂（1） 应采取终端灭菌工艺，建议首选过度杀灭法（F012），如产品不能耐受过度杀灭的条件，可考虑采用残存概率法(8F0酵母菌及霉菌革兰阳性细菌革兰阴性细菌病毒。具备核膜结构的真核微生物，在60一80下就可被迅速杀灭。绝大多数细菌的营养细胞在45以上就不能生长，80一100下就可被迅速杀灭，但是，某些嗜热细菌甚至可在80以上的高温中生存。多数病毒是热敏性的。需氧菌中的芽胞杆菌属(Bacillus)和厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属(Clostridium )，也具有较强的耐热性。这些细菌的细胞能产生内源性芽胞或胞间休眠休，它们一旦成熟，便会对热、干燥及有害化学物质等有较强的抗性。要想使这些芽胞在一分钟内死亡90%，则必须使干热温度在100-170之间或湿热温度在80-129之间才能达到这一目的。在这样的温度范围内，对芽胞的杀灭效果要相差约104或105倍。 细菌芽胞的耐热性与很多因素相关，芽胞形成时，细菌停止生化反应，并将遗传物质包于芽胞内。随之进行一系列生物物理变化:细胞质大量脱水并体积减小，然后在缩小的原生质体周围形成一层厚壳。此过程中形成了一种名为吡啶二羧酸或DPA(吡啶一2,6一二羧酸)的特殊化学物质。芽胞形成阶段，吡啶二羧酸钙与DNA以及细胞内的酶形成复合物，以保护处于恶劣环境中的芽胞。芽胞可以在休眠状态下存活多年，一旦条件利于萌发，便可在几分钟内恢复到生长状态。 （二）、影响灭菌效果的因素1.物理/化学条件 在细菌芽胞形成期，环境因子会影响其耐热性。例如，在较高温度下生长，并且有二价阳离子(如Ca 2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+)存在时，可增强芽胞的耐热性，当pH值超出6.0一8.0的范围时，或在芽胞形成环境中存在高浓度的盐水或磷酸盐，均会降低芽胞的耐热性。成熟芽胞的耐热性亦与环境条件相关，如溶液浓度、水活度，pH值或在环境中存在对芽胞造成物理性损伤或抑制其萌发的化学类物质，均会影响芽胞的耐热性。如果芽胞是包裹在晶体或有机物内，其耐热性通常明显高于非包裹性芽胞。2.湿度水在热力杀灭细菌芽胞时起着重要作用。湿热和干热灭菌均与水相关，当湿度达到饱和时相对湿度(RH)为100%，所进行的热灭菌方式称为湿热灭菌；在其他相对湿度下进行的灭菌都称为干热灭菌。现已知道，在90一125之间，当相对湿度在20%一50%时，细菌芽胞表现出最大的耐热性，而当相对湿度超出这一范围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。3.微生物的热致死特性通过一条半对数关系直线最能说明微生物的热致死性，直线的斜率随着温度升高而增大。这就是说，在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。这种一级致死特性是原核细胞独有的现象。（三）、热力学灭菌工艺原理简介1.湿热灭菌对于适宜采湿热灭菌方式的产品或物品湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。通常情况下，湿热灭菌是指采用一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没。水由液态变成气态时，会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量(即汽化热)。蒸气接触到温度较低的物体就会释放潜热而凝结成水，直到此物体的温度与蒸气温度相等。 现已明确，湿热灭菌的效应是导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用，这就是湿热灭菌较干热灭菌需要较低温度的原因。2.干热灭菌干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。干热灭菌时的相对湿度范围可从99.9%至1%以下。干热灭菌用加热介质就是一定湿度条件下的空气，通过强制对流而运动。由于热空气会带走水分，被灭菌物品1.0下面我们将以用产芽胞梭菌( Clostridium sporogenes)芽胞作为生物指示剂验证乳剂类产品灭菌工艺为实例，具体介绍生物指示剂的选择方法。 1.收集与产品灭菌工艺相关的基本资料 案例:某制药公司生产两种乳剂类产品(A和B)， 在进行生物学验证之前，产品灭菌工艺已经过物理验证而确定下来。因此，以上产品资料均可在生物学验证之前获取。灭菌前含菌量限度以及污染菌的耐热性限度均是以原材料的微生物含量和常规监控资料为基础而建立的;灭菌条件及Fq值控制是根据产品稳定性研究资料而建立的;验证用芽胞在每种产品中的实际耐热性资料由微生物实验室测得，并且通过热致死曲线的线性度发现产芽胞梭菌(Clostridium sparogenes)芽胞在上述两种产品内热稳定良好。 考虑到两种产品的规格相同、且在同一灭菌设备内灭菌并且灭菌工艺条件相似、以及生物指示剂芽胞在其中的耐热性也较为相近，只要验证其中的一个产品B即可，因为要采用Fo值控制范围的较低下限进行验证。但是，产品均是乳剂类产品，如直接将芽胞接种在产品内进行验证，势必给试验后的无菌检测带来很多麻烦。因此，可选择一透明澄清的标准溶液来替代上述二产品，只要芽胞在其中的耐热性不低于在两产品中的耐热性即可。 经测定，产芽胞梭状菌芽胞在氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.0)中的耐热性为1.4分钟，高于其在两产品中的耐热性，适合作为上述两产品灭菌工艺验证用标准溶液。 2.确定验证条件 根据本案例，验证条件确定如下:灭菌前产品含菌量限度设定为100个菌/袋，灭菌温度为116， Fo值为8分钟，以产芽胞梭菌芽胞作为生物指示剂，验证标准溶液为氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS)，验证试验瓶数量为20袋/次。 3.确定芽胞的接种数量 我们知道，当灭菌条件一定时，F0=D(lgN0-lgNi)。 产品中污染菌的最大耐热性D121=1.0分钟，那么，灭菌工艺使产品达到无菌保证值所需最小Fo值为: F0=1.0(lg100-lg10-6)=8分钟 与F0值的下限(验证条件)相符。 按下式计算验证用产芽胞梭菌芽胞的接种量: F0=D121(1gA-1gB) 根据阴性分数法，B=2.303 log(n/q) 其中，。为验证试验瓶总数;q为试验结果呈阴性的瓶数。假如所有的20只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时可假定只有19瓶呈阴性，那么，B=2.303lg(20/19)=0.0513,lgB=-1.29,lgA=F0/D121+lgB=8/1.4-1.29=4.4, A=104.4个菌.因此，每个挑战瓶内的芽胞接种量可控制在104105之间。(二)生物指示剂验证生物指示剂验证总是在灭菌设备的初始性能确认或产品的灭菌程序确认阶段进行。在随后的定期验证中，也要与物理验证一同进行。验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载，生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口(干热灭菌的排风口)等。应尽可能地将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相关性资料，这对偏差分析至关重要。放置在每个位置的生物指示剂均应做好标记，并且要与验证文件中生物指示剂的验证分布图相对应。验证时，采用相关产品的最低灭菌条件进行灭菌处理。灭菌程序结束后，将生物指示剂取出并清点数量并确认无误后，送至微生物室，于适当条件下培养检查。培养检查时，需要考虑阳性对照以及培养基的灵敏度等关键事项。在初始验证阶段，分别用生物指示剂在相同的灭菌条件下至少连续运行3次，以评价灭菌工艺条件的稳定性;在以后的定期再验证中，每次检测一批即可。验证时的生物指示剂分布、腔室内的产品装载及指示剂的控制要求均与过热灭菌工艺验证时生物指示剂的使用原则相同。(三)结果评价在上述验证条件下，只有连续3次试验的所有结果均合格(均呈阴性)方可证明相应灭菌工艺的可靠性。三、残存概率灭菌工艺残存概率灭菌工艺有时也被习惯地称作非过热灭菌工艺。因受产品耐热性或生产工艺等其他因素的制约，有些产品只能采用Fo值小于12分钟的灭菌工艺。在进行生物学验证时，需要采用残存概率法来选择并确定工艺验证用生物指示剂的使用及评价方法。 四、讨论 与过热灭菌工艺相比，残存概率灭菌工艺的灭菌效力相对较低较低的灭菌温度或较短的灭菌时间，Fo值一般控制在8-12分钟)，用商购的普通生物指示剂无法实现对残存概率灭菌工艺的验证。因为，商购的普通生物指示剂耐热性较高，一般用于验证F0值大于等于15分钟的灭菌工艺，而且在载体上的耐热性与在实际产品中的耐热性有相当大的差异。试验表明，嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)芽胞在孢子纸条或注射用水中的耐热性(D121)约为1.5分，但在乳剂内的耐热性约为2.4分钟。即使是直接将嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞加到产品溶液内，因其耐热性较高，只能加人较少数量(如Dl21值为2.4分钟，则单位验证产品中的胞子数量只能控制在100个左右才可能被完全杀灭)，这就难以直观反映实际灭菌工艺的可靠性和稳定性。 在同等条件(介质和温度)下，产芽胞梭菌芽胞的耐热性较嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的耐热性低，D121值在0.8-1.5分之间，并且它的耐热性也比较稳定。当验证F0值在8一12分钟的残存概率灭菌工艺时，根据产芽胞梭菌芽胞在实际产品溶液中的耐热性，可将单位验证产品中的孢子数量控制在l06个以上。因而能较直观表现实际灭菌工艺的灭菌效果。 采用残存概率灭菌法灭菌的产品，需要对每个灭