女贞子中总黄酮含量的测定毕业论文.doc

黄石理工学院 毕业设计（论文）女贞子中总黄酮含量的测定毕业论文目 录摘 要IABSTRACTII1 前 言11.1女贞子的形态特征11.2黄酮类化合物11.2.1黄酮类化合物的结构与类型. 21.2.2黄酮类化合物的物理性质. 31.2.3黄酮类化合物的化学性质. 41.2.3.1还原反应41.2.3.2络合反应41.2.3.3硼酸显色反应41.2.4黄酮类化合物的生理活性. 41.2.4.1抗自由基及抗氧化作用51.2.4.2抗肿瘤、抗癌作用51.2.4.3对心血管系统的作用61.2.4.4抑菌、抗病毒作用61.2.4.5抗衰老作用61.3黄酮类化合物提取方法71.3.1有机溶剂提取法. 71.3.2碱性水或碱性稀醇提取法. 71.3.3微波法协同提取. 71.3.4超声波法. 71.3.5超临界流体萃取法(Supercritical fluid extraction，SFE) . 81.4黄酮类化合物的定性检测81.5黄酮类化合物的定量分析91.5.1测定原理. 91.5.2分光光度计的使用原理. 91.6论文研究的目的、意义及主要内容101.6.1研究的目的及意义. 101.6.2论文主要研究内容. 112 材料与实验方法112.1实验材料、试剂与仪器设备112.1.1实验材料. 112.1.2 试剂. 122.1.3 主要仪器设备. 122.2 实验方法132.2.1 女贞子中黄酮类化合物含量的测定. 132.2.1.1 芦丁标准曲线的建立132.2.1.2 最佳波长的选择132.2.1.3 芦丁标准曲线回归方程的确立132.2.1.4 女贞子总黄酮提取物的制备142.2.1.5 样品中黄酮含量的测定152.2.3 黄酮类化合物的定性鉴定. 152.2.4 对比试验. 152.2.4.1 女贞子不同部位中总黄酮的含量152.2.5 单因素试验162.2.5.1 提取不同的时间162.2.5.2 不同的提取温度162.2.5.3 不同料液提取比162.2.5.4 不同浓度乙醇的提取162.2.6正交试验确定最佳提取工艺. 162.2.7 显色反应稳定性试验. 172.2.8 精密度试验. 172.2.9 方法重现性试验. 173 试验结果与分析173.1黄酮化合物的定性鉴定173.2 对比实验183.2.1女贞子不同部位中总黄酮的含量的对比183.3 单因素实验193.3.1 提取不同时间. 193.3.2 不同温度提取. 203.3.3 不同料液比提取. 203.3.4 不同浓度乙醇提取. 213.4 正交试验223.5 显色反应稳定性试验233.6 精密度实验243.7 方法重现性实验244 总结25致谢26参考文献27281 前 言女贞子又称女贞实、冬青子、白蜡树子，系木犀科女贞属植物女真(学名Ligustrum lucidum)的果实。女贞子树为常绿乔木，树皮光滑不裂。叶对生、全缘、无毛、革质、背面密披细小的透明腺点。女贞原生于我国长江流域及南方各地、河南、陕西、甘肃等地，作为园林绿化植物，北方不太寒冷的地方也有引种，在朝鲜南方、印度也有分布。女贞子是一味传统的扶正固本药物，神农本草经列之为上品，谓其“味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病。”李时珍谓其“果实强阴健腰膝，变白发，明目”。现代医学表明，女贞子具有补腰膝、壮筋骨、强阴肾、乌须发、治疗神经衰弱和风热赤眼等作用，是一种兼具营养和药理作用值得开发的植物资源1。1.1 女贞子的形态特征女贞子为女贞的干燥成熟果实，呈卵形、椭圆形或肾形，长68.5，直径3.55.5，表面黑紫色或灰黑色，皱缩不平，基部有果梗痕或具宿萼及短梗。体轻，外果皮薄，中果皮较松软，易剥离，内果皮木质，黄棕色，具纵棱，破开后种子通常为1粒，肾形，紫黑色，断面类白色，油性。气微、味甘、微苦涩。1.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类重要的天然色素，也是中药中一类重要的有效成分。其在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。又由于分子中吡酮环上的氧原子能与强酸成盐而表现为弱碱性，因此曾称为黄碱素类化合物2。1.2.1 黄酮类化合物的结构与类型黄酮类化合物以前是指2苯基色原酮为基本母核的化合物，现在是指两个具有酚羟基的苯环(A、B环)通过中央3个碳原子连接而成的一系列化合物的总称3。根据中央三碳链的氧化程度、是否成环以及B环在C环上的连接位置(2或3位)等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类，如表11所示。表11黄酮类化合物苷元的主要结构类型类型 基本结构 类型 基本结构1.2.2 黄酮类化合物的物理性质1. 性状黄酮类化合物大多数为结晶性固体，具有一定的结晶形状，少数(如黄酮营类)为无定形粉末。黄酮类化合物多为黄色，其颜色深浅与其是否具有交叉共扼体系、助色团的多少有关，一般具有交叉共扼体系的黄酮类化合物(如黄酮、黄酮醇、查尔酮)多呈黄色或颜色较深，而不含有交叉共轭体系的黄酮类化合物(如二氢黄酮、二氢查尔酮、异黄酮)多无色或颜色较浅4。黄酮类化合物在紫外光下一般具有荧光，荧光颜色与分子结构有关。如C3OH(黄酮醇)显亮黄色或黄绿色荧光，但当其甲基化或糖苔化后，或无轻基(黄酮类)时，仅显暗淡的棕色5。2. 溶解性黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态(苷或苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷)不同而有很大差异。一般游离试元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酷、乙醚等有机溶剂及稀碱中。其中黄酮、黄酮醇、查尔酮等平面型黄酮类化合物分子间引力较大，各分子层层重叠，难溶于水；而二氢黄酮、二氢黄酮醇及异黄酮等非平面型黄酮类化合物处于半椅式结构，破坏可分子平面性，分子间引力较小，其水溶性大于上述平面型黄酮类化合物。黄酮类化合物糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于热水、甲醇、乙醇、稀碱溶液，而难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等亲脂性有机溶剂。游离黄酮及黄酮苷一般都含酚经基，故都可溶于碱中，加酸后又沉淀出来，可利用此性质提取、分离黄酮类化合物6。3. 酸碱性黄酮类化合物因分子中多具有酚轻基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶中。由于黄酮类分子中有未共用的孤对电子，故又表现有碱性，可以与无机酸如硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐不稳定，遇水后即可分解。黄酮类化合物与硫酸反应生成的盐，常表现出特殊的颜色，由此可以鉴别黄酮类化合物6。1.2.3 黄酮类化合物的化学性质1.2.3.1 还原反应1. 盐酸锌粉反应这是检查是否有黄酮类化合物的最常用方法之一。将样品溶于甲醇或乙醇，加入少许锌粉振摇，再滴加几滴浓盐酸，12分钟内(必要时微热)即可出现颜色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红、紫红色，少数显紫蓝色，且B环上有O或OCH3取代时，颜色即随之加深。但查耳酮、橙酮、儿茶素类则不显反应。异黄酮类除少数例外，均不显色7。2. 四氢硼酸酸钠(钾)反应该还原剂是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂。反应产物为红色或紫色，其它黄酮类化合物均为无颜色反应7。1.2.3.2 络合反应黄酮类化合物分子可以与铝盐、铅盐、镁盐生成黄色并具有荧光的络合物，可用于黄酮的定性或定量分析。1.2.3.3 硼酸显色反应取12样品溶于去离子水中，加1ml 15%硼酸溶液，充分振荡后，若溶液颜色呈现亮黄色，则示有5羟基黄酮或2羟基查耳酮，而其它黄酮类均为负反应7。1.2.4 黄酮类化合物的生理活性天然黄酮类化合物是植物体多酚类的内信号分子及中间体或代谢物。由于黄酮类化合物广泛分布于植物中，其生理活性多种多样，引起了国内外广泛注意，研究进展很快，目前已分离出的黄酮类化合物总数超过4000个。大量研究证明：黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等疾病的治疗和预防有重要的意义。此外，还可用作食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等。因此，成为近几年研究、开发、利用的热点，其在医药、食品领域具有广阔的应用前景8。1.2.4.1 抗自由基及抗氧化作用自由基与人的病理(心脏病、糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿等)、生理(衰老)有密切关系。生物体内常见的自由基有超氧自由基，羟自由基、烷氧自由基。自由基性质活泼，有极强的氧化能力，对人体能造成极大的危害，在体内自由基和脂质过氧化作用下能使大分子成分发生氧化变性、DNA交联和断裂，导致细胞结构改变，从而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病9。黄酮类化合物有很好的清除自由基和抗氧化能力，对防止疾病以及人的健康有积极的作用，作用机理包括：与超氧自由基反应阻断自由基引发的连锁反应；与金属离子螯合阻断自由基生成；与脂质过氧化基(ROO)反应阻断脂质过氧化过程。1.2.4.2 抗肿瘤、抗癌作用黄酮类化合物有较强的抗病毒、抗肿瘤作用。起作用可通过三种途径：抗自由基直接抑制抗癌细胞生长和对抗致癌促癌因子。致癌因子使体内产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质癌细胞膜的周围，引起脂质过氧化，破坏细胞的DNA而致癌，黄酮类化合物是自由基破灭剂和抗氧化剂，能有效阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌、防癌的作用。许多黄酮类化合物具有抑制肿瘤细胞糖酵解、生长、线粒体琥珀酸氧化酶和磷脂肽肌醇激酶(卵巢癌细胞中)活性的功能，起到抗癌、防癌的作用。1.2.4.3 对心血管系统的作用黄酮类化合物对心血管疾病的预防和治疗主要是基于对低密度脂蛋白LDL氧化的防止作用10。具有扩张血管，防止低密度脂蛋白(LDL)氧化作用11，并对主动脉内皮细胞腺苷脱氨酶有抑制作用，可用于防止由高血压引起的头痛、头晕、耳鸣等症状；具有变时性调节心肌收缩的作用，改善心肌舒张功能、对抗垂体后叶素引起心急缺血、缩小因结扎冠状动脉而引起的心肌梗塞、提高机体在常压与低压下的耐缺氧能力、对抗各种因子造成的心律失常，可用于治疗心律失常、心绞痛、心肌梗塞等症；具有较好的抗凝血作用11。此外黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢，是内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬化。1.2.4.4 抑菌、抗病毒作用黄酮类化合物具有抑菌、抗病毒作用13，如银杏叶黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚等均有抑菌和抗病毒作用。Kievitone(一种异黄酮化合物)在极低浓度时就对人体致病革兰氏阳性菌，如白喉杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌有较强的抑制作用。1.2.4.5 抗衰老作用细胞老化是机体老化的基础，生物膜在细胞老化过程中起着重要的作用，若细胞膜受到损伤，必然会引起膜抗氧化能力的降低，自由基清除能力的减退，体内SOD活力降低，免疫功能下降，氧化产物MDA(丙二醛)含量增加，进而导致衰老。黄酮类化合物可提高SOD活性，减少体内MDA含量，延缓衰老进程，提高生命力及生存等能力；能增强神经细胞活力，减少乳酸脱氢酶(LDH)释放，减轻细胞和形态的改变和DNA的断裂，对神经细胞凋亡有抑制作用。甘草总黄酮可以增强脾虚衰老小鼠SOD活性，减少体内MDA含量，延缓衰老进程，提高生命力及生存等能力14。1.3 黄酮类化合物提取方法1.3.1 有机溶剂提取法这是目前国内使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产，它是利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取。一般游离苷元，难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。黄酮类化合物成苷后，随着引入羟基的增多，在水中的溶解度增加，在有机溶剂中溶解度相应减小，黄酮苷类一般溶解于水，甲醇，乙醇等强极性的溶剂中15。由于甲醇、丙酮等毒性较大，因此有机溶剂提取法中最常采用乙醇作为萃取剂。60%左右的乙醇适用于提取甙类，90%的醇适用于甙元，对设备要求简单，产品得率较高，但成本较高，杂质含量也较高16。1.3.2 碱性水或碱性稀醇提取法由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水(如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液)或碱性稀醇(如50%的乙醇)浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出杂质较多。石灰水的优点是使含有多羟基的蹂质，或含有羧基的果胶、粘液质等水溶性杂质生成钙盐沉淀，有利于浸出液的纯化。石灰水的缺点是浸出效果不如稀氢氧化钠水溶液，有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出17。1.3.3 微波法协同提取微波辅助提取技术是近年以传统溶剂浸提法原理为基础发展的新型萃取技术，该技术具有选择性高、耗时少、能耗低、排污量少等优点，可克服传统提取方法的缺陷，与超临界流体萃取、高速逆流液相色谱等技术相比，适用面更广，且设备投资低，是目前国内外天然产物提取的研究热点18。1.3.4 超声波法超声波法的原理是利用超声波产生的强烈震动、高的加速度、强烈的空话效应、搅拌作用等加速药物有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并且免去高温对提取成分的影响。超声波对媒质主要产生独特的机械震动作用和空化作用。当超声波振动时能产生并传递强大的能量，引起媒质质点以大的速度和加速度进入振动状态，使媒质结构发生变化，促使有效成分进入溶剂中。同时在液体中还会产生空化作用，即在有相当大的破坏力作用下，液体内形成空化泡的现象。另外，超声波的次级效应如热效应、乳化、扩散、击碎，化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速植物有效成分在溶剂中的扩散释放，促进植物有效成分充分与溶剂混合，有利于提取。1.3.5 超临界流体萃取法(Supercritical fluid extraction，SFE)近10年来，随着超临界流体提取(SFE)技术的迅速发展，在天然药用植物有效成分提取中应用越来越广泛。它和上述提取工艺相比较，具有提取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。同时还可以通过控制临界温度和压力的变化，来达到选择性提取和分离纯化的目的。因此，在当今人们渴望回归大自然的潮流中，该提取方法倍受青睐，用超临界二氧化碳提取银杏叶黄酮类成分的方法，已受到人们的关注，在欧洲己有专利报道19。1.4 黄酮类化合物的定性检测黄酮类化合物分子中存在酚羟基和苯并吡喃酮环，其显色反应主要利用了这些基团的性质。各类黄酮化合物的显色反应主要有：还原实验(HCl-Zn)；金属盐类试剂的配位反应(如铝盐、铁盐)；酸性显色反应；碱性显色反应20。具体显色现象见下表：表12各类黄酮化合物的显色现象类别 黄酮 黄酮醇 二羟黄酮 查耳酮 异黄酮 橙酮盐酸+锌粉 红 紫红 紫红 柠檬酸 绿黄 绿黄 黄 硝酸铝 黄 黄绿 蓝绿 黄 黄 三氯化铁 绿褐色 氢氧化钠 黄 深黄 黄 橙 黄 红硼酸 亮黄色 1.5 黄酮类化合物的定量分析1.5.1 测定原理黄酮类化合物主要包括黄酮苷和黄酮醇苷两大部分。在植物体内多以游离态或与糖结合成苷的形式存在，黄酮类化合物的定量测定方法常用的有HPLC法和分光光度法。在实际生产和科研过程中，考虑到方法的简便、快捷以及可行性，对总黄酮的测定，多采用NaNO2Al盐NaOH络合法21：该法主要以芦丁为对照品，先用NaNO2还原黄酮，再用Al盐络合，最后加NaOH溶液显色，产生红色化合物进行比色测定，是使用最广泛的中草药、中药制剂总黄酮类化合物的测定方法，在黄酮类化合物溶液中加入Al3+试剂后，黄酮类化合物中的酚羟基与Al3+生成络合物，控制适宜的PH值，所生成的络合物在可见区能获得特征吸收峰，其质量浓度与吸光度符合比尔定律，其颜色的深浅与黄酮类化合物的量成一定的比例关系，可以定量测定。1.5.2 分光光度计的使用原理分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量的分析22。常用的波长范围为：(1)200400 nm的紫外光区(2)400760 nm的可见光区(3)3.225m(按波数计为4000-1400BCD。最佳的浸提条件为A2B2C2D1，即以80%的乙醇为提取剂在90、料液比为1:40的条件下提取2.5小时，按照上述最佳提取工艺条件对女贞子中黄酮类化合物进行提取，测定原料中的黄酮类化合物含量为11.827。3.5 显色反应稳定性试验提取液显色后，选择三份不同的提取液，每隔十分钟测一次吸光度，连连续测定至90分钟，确定提取液显色后的稳定性。表3-9提取液显色稳定性实验结果显色时间 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 吸光度 0.646 0.645 0.644 0.644 0.644 0.643 0.643 0.643 0.642 0.641 0.708 0.708 0.707 0.706 0.705 0.705 0.704 0.703 0.702 0.701 0.735 0.735 0.735 0.734 0.734 0.733 0.732 0.732 0.732 0.731由表3-9中根据显色反应在不同时间内所测的吸光度值可以看出，该显色反应所产生的有色物稳定，在较长时间内基本上不会发生改变，说明分光光度法测定黄酮结果稳定可靠，适宜做定量分析。3.6 精密度实验准确吸取1.0ml待测样液5份，显色并测定其吸光度，计算黄酮含量。结果见下表：表3-10精密度实验序号 1 2 3 4 5吸光度 0.622 0.626 0.620 0.623 0.628 黄酮含量% 8.071 8.123 8.046 8.084 8.149平均值 8.095相对偏差% -0.296 0.346 -0.605 -0.136 0.667标准差 0.0412变异系数(%) 0.509从上表结果看出，用分光光度法测定女贞子中总黄酮含量，结果标准变偏差和变异系数均较小，说明该方法的精密性、准确性良好，切测定条件易控制，测定结果较满意。3.7 方法重现性实验五份2.5g女贞子粉末，用100ml 80%的乙醇提取3小时，显色并测其吸光度值，计算黄酮含量，结果见下表：表3-11重现性试验结果序号 1 2 3 4 5吸光度 0.824 0.796 0.815 0.809 0.783 黄酮含量% 10.673 10.312 10.557 10.480 10.145平均值 10.435相对偏差% 2.280 -1.179 1.169 0.431 -2.779标准差 0.208变异系数(%) 1.99从上表结果可以看出，用本方法提取总黄酮时，测定含量的标准差和变异系数较小，说明该方法的重现性较好，符合实验要求。4 总结本文以女贞子粉末为研究对象，对索氏提取法提取女贞子中总黄酮的各种影响因素进行了研究，并通过正交试验确定了最佳提取条件。1、确定了以芦丁标准品为对照品的可见分光光度计法测定黄酮含量，其检测波长为506nm；回归方程为：C=0.1288+0.0006，相关系数r=0.9994。2、通过对比试验初步探讨了女贞子各个部位总黄酮的含量，结果表明女贞子果皮中总黄酮的含量最高。3、通过黄酮类化合物的颜色反应，初步确定了女贞子中总黄酮包含黄酮类、二羟黄酮和黄酮醇类。4、通过单因素试验确定了正交试验各个影响因素的设定范围，然后对影响黄酮类化合物的因素进行了正交试验和影响因素分析，结果表明乙醇提取女贞子中黄酮类化合物的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%，料液比1:40，提取温度90，提取时间