仙人掌中抑菌活性成分的提取与分析.doc

仙人掌中抑菌活性成分的提取与分析第31卷第6期河南工业大学(自然科学版)2010年l2月JournalofHenanUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition)Vo1.31,No.6Dec.20lO文章编号:1673-2383(2010)06-005804仙人掌中抑菌活性成分的提取与分析缪晓平,邓开野(仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225)摘要:采用响应面分析法得出仙人掌抑菌活性成分的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数76.96%,料液比1:29.92,浸提温度69.4OoC,浸提时间5.19h.对仙人掌提取物做了抗茵谱的测定,结果表明,具有较宽的抗茵谱.仙人掌提取物对金黄色葡萄球茵,大肠杆菌,根霉,青霉和酿酒酵母的MIC分别为6.25g/L,3.125g/L,6.25g/L,12.5g/L和25g/L.对仙人掌提取物进行稳定性测试,结果表明仙人掌提取物的抑菌活性具有较好的热稳定性,对紫外光照射稳定,pH46范围内抑菌效果稳定.关键词:仙人掌;抑菌;提取;响应面分析法中图分类号:TS201.2文献标志码:B0引言防腐剂在食品生产加工和储藏中起着重要的作用,由于合成食品添加剂往往具有一定的毒副作用,寻找天然防腐剂已成为当今世界食品添加剂的一大趋势.仙人掌含有丰富的类黄酮化合物,生物碱,甾类化合物,三萜类化合物及有机酸等成分.,它们是各种植物中常见的对食品中腐败菌及致病菌具有抑制效果的化学成分,仙人掌将成为食品天然防腐剂的重要来源之一.作者优化了仙人掌中抑菌活性成分的提取条件,并对其进行分析,为仙人掌资源在食品天然防腐剂中的开发利用提供理论依据和技术支持.1材料与方法1.1材料和仪器原料与试剂:仙人掌,市售;乙醇,牛肉膏,蛋白胨,琼脂粉,生理盐水,蔗糖,葡萄糖,NaC1,广东环凯微生物科技有限公司.供试菌种:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,根霉,青霉,酿酒酵母,仲恺农业工程学院生物工程实验室提供.收稿日期:2Ol0_061O作者简介:缪晓平(1985一),男,广东汕尾人,硕t研究生,研究方向为发酵工程.通信作者培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,PDA培养基,LB培养基.主要仪器:101As一3电热鼓风干燥器,上海浦东跃欣科学仪器厂;LRHl50一S恒温恒湿培养箱,广东省医疗器械厂;W201D恒温水浴锅,上海申顺生物科技有限公司;SwCJlF超净台,苏州净化设备厂;YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器,上海三申医疗器械有限公司;80一l型离心机,上海手术器械厂.1.2方法1.2.1仙人掌抑菌活性成分提取工艺准确称取仙人掌,洗净切条后置烘箱中烘干,粉碎,然后与乙醇溶液混合,常温浸提,抽滤,合并滤液减压蒸馏,除去乙醇,并浓缩,制成1g/mL的仙人掌乙醇浸提液.1.2.2滤纸片法测定抑菌圈直径无菌条件下将灭菌的培养基倒人培养皿中.将培养的供试菌种制成菌悬液,然后注入相应的培养皿中,使菌液分布均匀.将浸入提取原液的滤纸片稍晾干后放入培养皿,每皿正三角形放置3片,与培养基完全接触.每份样品平行接种3个培养皿.培养箱培养,细菌于37培养24h,霉菌于28培养48h,酵母于30培养24h,取出观察,用游标卡尺量取抑菌圈的直径(mm),求平均值.1.2.3最小抑制浓度MIC的测定取若干只灭菌试管,顺序编号,以适合供试菌11长的液体培养基将被测的仙人掌提取物进行一第6期缪晓平,等:仙人掌中抑茵活性成分的提取与分析59系列对倍稀释,浓度分别为100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56g/L,同时设空白对照组.各试管加入菌悬液50L,培养箱培养,细菌于37培养24h,霉菌于28培养48h,酵母于30培养24h,取出观察判定结果,以含药量低而无肉眼可见菌生长的一管含药量为药物对该菌的MIC.1.2.4仙人掌提取物稳定性试验H1.2.4.1温度对仙人掌提取物抑菌活性的影响以大肠杆菌为指示菌,将仙人掌提取物分别置于40,60,80,100水浴和121湿热条件下,热处理30min,对照样置于30cI=,用滤纸片法来测定其抑菌圈,试验重复3次.1.2.4.2pH值对仙人掌提取物抑菌活性的影响用不同pH值的磷酸缓冲溶液分别调节培养基的pH值为2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0共6个梯度,以大肠杆菌为指示蔺,用滤纸片法来测定其抑菌圈直径,试验重复3次,同时以未添加提取物的缓冲液培养基为空白对照,根据抑菌圈大小来判断提取物的酸碱稳定性.1.2.4.3uV对仙人掌提取物抑菌活性的影响取仙人掌提取液若干份,将其置于紫外灯下分别照射5min,10min,15rain,20rain,25rain,30min后,原液作为对照,以大肠杆菌为指示菌,测定其抑菌效果,重复3次.2结果与分析2.1响应面分析法优化仙人掌抑茵活性成分的提取工艺在单因素试验的基础上,选取乙醇体积分数,液料比,提取温度,提取时间各因素的最优试验范围,研究按照表1的因素与水平,以抑菌圈直径(大肠杆菌)为响应值,采用响应面分析法对其进行优化,以确定仙人掌抑茵活性成分最佳提取条件.结果见表2,表3.表1试验因素与水平表2试验设计及结果表3回归方程各项的方差分析方差来源自由度平方和均方F值显着性显着A一乙醇体积分数B一浸提温度C一浸提时间19一液料比ABACAD曰CBDCDABCD残差失拟性纯误差总差40.172.885.OO0E一0030.16O.18O.0l76.13O.421.440.50O.189.395.352.88l4.O5O.】20.0920.02840.292.872.885.o0OE一003O.160.180.0176.13O.421.440.5OO.189.395.352.8814.O50.0200.0467.000E一0036.59不显着注:Prob>F值如果小于0.05,说明对应的因素对响应值影响显着OO3617)815l0)咖m加mm(000O<00OO,<:强妈.2998.(u9.舡瑚H,624加河南工业大学(自然科学版)第31卷根据表2试验结果,由DesignExpert软件得出的抑菌圈直径(大肠杆菌)是关于4因素的二次回归拟合方程:抑菌圈直径(大肠杆菌)=14.86+0.71A一0.030B+0.11C+0.18D一0.072AB一0.88AC一0.35AD+0.42BC+0.39BD一0.15CD一0.79A一0.60B一0.44C一0.97D.根据方差分析可知,所建立的模型显着,失拟项不显着,说明该模型与实际情况拟合很好,可预测最佳提取条件.AC,AD,BC,BD,CD之间的交互作用也很显着,由F检验可以得到各因素对提取条件影响的主次顺序是:乙醇体积分数>液料比>浸提时间>浸提温度.根据所建立的数学模型应用响应面设计法优化出其最佳提取条件:乙醇体积分数76.96%,料液比l:29.92,浸提温度69.4O,浸提时间5.19h,此时抑菌圈直径(大肠杆菌)为14.9362mm.在上述预测工艺参数条件下,取乙醇体积分数77%,液料比l:30,浸提温度69,浸提时间5h,做3次平行试验,实测抑菌圈直径(大肠杆菌)为14.91mm,与预测值无显着差异.这一结果证实试验优化的工艺参数是可行的.2.2最佳提取条件下仙人掌提取物抗菌谱研究最佳提取条件下,仙人掌提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,根霉,青霉,酿酒酵母的抑菌圈直径见表4,由此可以看出仙人掌提取物对细菌,霉菌和酿酒酵母都有很强的抑制效果,其抗菌谱较宽.表4仙人掌提取物的抑茵直径mm2.3最低抑菌浓度(MIC)仙人掌提取物对供试菌的MIC测定结果见表5.表5仙人掌提取物对供试菌的,C的测定巾+表,柯菌落出现;一表示没有菌落出现从表5可以看出,仙人掌提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为6.25g/L,对大肠杆菌的MIC为3.125g/L,对根霉的MIC为6.25g/L,对青霉的MIC为12.5g/L,对酿酒酵母的MIC为25g/L.由此可知,仙人掌对供试菌有较强的抑制作用.2.4仙人掌提取物稳定性的研究2.4.1温度对仙人掌提取物抑菌活性的影响以大肠杆菌为指示菌,测定不同温度下仙人掌提取物的抑菌活性,结果见图1.E匿滴嚣图1温度对仙人掌提取物抑茵活性的影响由图1可以看出,仙人掌提取物经不同温度处理后抑菌活性差别不大,基本保持原有的抑菌活性,即使在121oC处理30min后仍具有较高活性.这表明仙人掌提取物的抑菌活性具有较好的热稳定性.2.4.2pH对仙人掌提取物抑菌活性的影响以大肠杆菌为指示菌,研究不同pH对仙人掌提取物抑菌活性的影响,结果见图2.g涮匦璃量图2pH对仙人掌提取物抑茵活性的影响大肠杆菌在缓冲液对照组和加入提取物的不同pH值培养基中生长几乎趋势相同,仙人掌提取物的抑菌效果受pH的影响,酸性条件下的抑菌效果较好,在碱性条件下,提取物抑制菌体能力均有所下降,在pH46范围内,仙人掌提取物对菌体的抑制作用较高且稳定性很好.第6期缪晓平,等:仙人掌中抑茵活性成分的提取与分析612.4.3UV对仙人掌提取物抑菌活性的影响以大肠杆菌为指示菌,研究紫外光照射对仙人掌提取物抑菌活性的影响,结果见图3.E匦璃嚣图3uV对仙人掌提取物抑菌活性的影响由图3可以看出,随紫外光照射时问的增加,仙人掌提取物的抑菌活性有所下降之后,有一定的提高,然后基本维持不变.由此可见仙人掌提取物对紫外光具有较高的稳定性.3结论采用滤纸片法,以抑菌圈直径为评价标准,大肠杆菌为指示菌,优化提取工艺.采用响应面分析法得出最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数76.96%,料液比1:29.92,浸提温度69.40,浸提时间5.19h.对仙人掌提取物做了抗菌谱的测定,结果表明它具有较宽的抗菌谱.仙人掌提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,根霉,青霉和酿酒酵母的MIC分别为6.25g/L,3.125g/L,6.25g/L,12.5g/L和25g/L.对仙人掌提取物进行稳定性测试,结果表明仙人掌提取物的抑菌活性具有较好的热稳定性,对紫外光照射稳定,pH46范围内抑菌效果稳定.参考文献:1彭百承,李萍.仙人掌研究概况J.时珍国医国药,l999,10(2):149150.2董颖苹,黄琼,黄先群,等.药用植物仙人掌的研究进展J.贵州农业科学,2001,29(2):63-65.3王钊,林琳,鲍世铨.我国海南仙人掌的成分分析及开发前景J.天然产物研究与开发,2000,13(1):44-48.4黄秀梨.微生物学实验指导M.北京:高等教育出版社,1994.5姚淑敏.芦荟提取物抑茵作用的研究J.食品科学,2002,23(4):137139.6郭志坚,郭书好,何康明.黄柏叶中黄酮醇甙含量测定及其抑菌实验J.暨南大学学报:自然科学版,2002,23(5):64-66.7昊传茂,吴周和,曾莹,等.从植物中提取天然防腐剂的研究J.食品科学,2000,30(5):24-27.EXTRACTIONANDANALYSISOFANTIBACTERIALACTIVECOMPONENTSOF0尸CS一,C4MIAOXiao-ping,DENGKaiye(CollegeofLightIndustryandFoodTechnology,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou510225,China)Abstract:ThepaperstudiedtheoptimalextractionconditionsofantibacterialactivecomponentsofOpuntia?CltSindicabyresponsesurfaceanalysis,anddeterminedtheantibacterialspectraoftheextract.Theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionswereasfollows:ethanolvolumefraction76.96%,solid.1iquidratio1:29.92,extractiontemperature69.40,andextractiontime5.19hours;andtheextracthadwideantibacterialspectra.TheMICsoftheopuntiaficusindicaextractagainstStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Rhizopus,PenicillumandSaccharomycetewere6.25g/L,3.125g/L,6.25g/L,12.5g/Land25g/L,resp