项目名称：重要亲源分子对胚层诱导和分化的调控首席科学家：.doc

项目名称：重要亲源分子对胚层诱导和分化的调控首席科学家：孟安明 清华大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标1.总体目标人类和脊椎动物的生命周期起始于受精卵胚胎的早期发育，对该过程的深入了解对于优生优育、人类健康和医学、畜禽生产、物种保护等都有重要的潜在价值。本项目将稳定一支高学术水平的研究团队，充分利用斑马鱼、爪蛙和哺乳动物细胞系等研究系统的优势和互补性，重点研究母源和父源因子，研究它们在胚胎卵裂、体轴决定、胚层形成、细胞分化与迁移等过程中的作用，深入了解它们发挥功能的分子机制和调控网络，从而更全面、系统地认识脊椎动物早期胚胎发育的分子调控网络；在相关领域取得一些理论、方法和技术突破，促进我国基础医学和生殖、代谢、干细胞相关疾病等领域的发展；培养高水平研究人才，形成能够持续进行创新性研究的能力；促进我国发育生物学学科的发展。2.五年预期目标在五年的实施过程中，本团队将围绕设定的关键科学问题，从分析胚层的决定和分化、卵母细胞及早期卵裂的周期控制以及干细胞分化潜能的控制等生物学现象入手，实现如下目标： 1）鉴定一批脊椎动物母源因子，明确数个因子在早期胚胎胚层诱导和分化中的作用，认知中囊胚转换的分子调控机理；发现相关的新的信号通路或新的信号网络调控机制，加深对早期胚胎发育调控机理的认识。2）鉴定一批脊椎动物父源特异性RNA，有可能突破性地发现父源RNA在胚胎早期发育中的普遍作用和特异性作用及其机理。3）了解已知的几个多能性因子在胚层形成和分化中与母源胚层决定信号之间的调控关系，探索数个母源或父源因子在干细胞多能性和定向分化中的作用。4）建立新的母源和父源因子鉴定和功能研究技术，完善相应当研究平台。5）发表高影响因子文章510篇；在国际主流期刊上发表论文5080篇。6）培养可持续发展的学术梯队：博士后、副研究员10-12名；博士生40-50名；技术支持人员8-10名三、研究方案总体研究方案1学术思想本项目的中心学术思想是以斑马鱼和爪蛙为模式生物，辅以哺乳动物胚胎干细胞研究系统，从分子、细胞和胚胎整体水平阐述胚胎早期发育过程中，预存于卵子和精子中的亲源分子在胚层发育中的功能和调控机制，着力于未知亲源分子的鉴定、发育功能分析、基因表达调控机制分析和对细胞信号通路的新的调控机制的探索。2技术路线本项目将利用斑马鱼和爪蛙两种模式动物的优势，采用反向遗传分析和正向遗传分析的策略，鉴定与胚层形成相关的母源和父源因子，然后利用已有的基因表达、功能和机制研究技术手段，探讨这些因子在早期发育中的功能和作用机制。在利用正向遗传学方法研究斑马鱼母源因子对胚层诱导和分化的影响方面，我们利用Tol2转座子插入法捕获母体基因，当转座子基因组（含GFP报告基因）插入到一个母体基因内时，GFP报告基因的表达将受该母体基因启动子的控制，因而在卵母细胞中可观察到GFP的存在；通过TailPCR、inverted PCR、RACE等方法，可以比较容易地克隆出该母体基因。如果杂合体之间配种得到的F2纯合体能够长大到性成熟，雌性个体因该母源基因被转座子破坏而不能表达出有功能的蛋白，其产出的卵子中就缺乏该母源基因产物，与野生型或杂合型雄性个体的精子受精后的胚胎就可能出现胚层诱导和分化等方面的缺陷，称之为母源突变体。我们获得母源突变体之后，将检测突变体胚胎中各个胚层的标记基因的表达、Wnt、Nodal、BMP等关键发育信号通路的组份的表达；在突变体中过表达一些胚层诱导和分化的关键基因如sqt、beta-catenin、bmp2b、fgf8、sox32等,确定它们与突变的母源基因之间的遗传互作关系。为了深入阐明有重要功能的母源因子的作用机理，将利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术途径鉴定其互作因子，再在哺乳动物细胞系中研究其在相关信号通路中的作用，获得的结果再回到胚胎中进行验证。另一方面，对于那些在斑马鱼上发现的有重要功能的母源基因，将在爪蛙胚胎上检验其功能的保守性。在反向遗传分析方面，我们将结合转录组分析和卵母细胞基因下调技术鉴定参与爪蛙胚层形成的母源基因，利用转录组分析技术（比如deep sequencing）鉴定斑马鱼父源特异性RNA。然后设计特异性的吗啉环修饰的反义寡核苷酸去抑制相应基因的mRNA（或小RNA）的表达。在爪蛙上，将反义寡核苷酸注射到收集的卵母细胞中，可以有效地剔除储存在卵母细胞中的目标mRNA，体外培养2天后(可以使原来已存在的蛋白降解)，再将卵母细胞回移到处理过的雌蛙输卵管中，并进行自然受精（本项目组成员陶庆华教授实验室是全世界屈指可数熟练掌握该方法的团队）。在斑马鱼上，我们正在建立类似的技术。抑制父源特异性RNA相对比较简单（因为进入卵子的特定父源RNA的量极少），将反义寡核苷酸注射到单细胞受精卵中即可。对于注射了反义寡核苷酸的胚胎，将首先从形态学上观察胚胎的胚层变化，然后检测常用的胚层标记基因的表达，确认其可能的作用。在鉴定到对胚层形成有重要影响的父源或母源基因后，我们将根据其表达谱、表达产物的性质和突变体表型，利用体内、体外系统研究其发挥生物学功能的分子机理。考虑到Wnt和TGF-beta信号，以及细胞全能性相关因子在胚胎早期发育中起着广泛而重要的作用，因此鉴定出对胚层形成有重要影响的亲源基因后，将重点研究它们与细胞信号网络和细胞分化调控因子的相互作用关系。另一方面，TGF-beta和Wnt信号，以及与干细胞全能性相关的重要调控因子大多数都在早期胚胎发育、特别是胚层形成中发挥重要作用，因此我们也计划分析TGF-beta和Wnt信号相关调控因子以及干细胞全能性相关因子（如Oct4， nanog， Klf4等）在胚层形成中的功能和作用机制。在前期工作中，我们已经通过酵母双杂交、染色体免疫沉淀、基因芯片等技术发现了许多受Wnt和TGF-beta信号通路调节的基因，以及与这两个信号通路上的介导因子或调节因子相互结合的蛋白，在本项目中将重点研究它们在胚胎早期发育，特别是胚层形成中的功能和对相关信号通路的调控机理。在研究它们的生物学功能方面，将主要开展以下分析：1）利用原位杂交确定它们在胚胎发育中的时空表达谱；2）将体外合成的野生型mRNA或突变型mRNA注射到胚胎中，观察其对胚胎图式发育的影响，并检测相关标记基因表达的变化；3）合成Morpholino反义寡核苷酸，将其注射到胚胎或爪蛙的卵母细胞中，使相应基因功能被减弱或失活，观察胚胎发育异常（检测形态和标记基因）；4）将一个基因的mRNA或反义寡核苷酸与相关信号通路的其它基因的mRNA或反义寡核苷酸组合注射，探讨基因互作关系，建立相关发育途径的分子调控网络。在研究新基因对信号通路的调节机理方面，将主要利用体外的细胞培养系统，分析内容主要包括：1）该基因过表达或被抑制时对Wnt和TGF-beta信号的影响；2）过表达或被抑制时对Wnt和TGF-beta信号通路中的介导因子或调节因子的表达、修饰或稳定性的影响；3）亚细胞定位及其动态变化；4）功能域的鉴定；5）获得的机理在体内系统中的验证，希望获得相应的遗传学证据。在研究策略上，我们将充分发挥这两种模式生物的特色和技术优势，特别注意两种模式动物研究系统之间的结合、胚胎体内研究与培养细胞体外研究之间的结合、以及不同信号通路之间的交互作用研究，从而保证研究成果的高质量、高水平，在分子机理上认识胚层诱导和分化、母源-合子转换等发育过程的调控规律。3创新点和特色本项目关注的生物学问题是胚胎发育中胚层的诱导和分化，这是所有动物发育过程中的重要阶段，是多细胞生物形成的最原始和最基础性的事件。现有的研究结果显示，胚层的发育是精卵配子中预存的亲源因子和受精卵合子基因之间互作的结果，其中亲源因子起到了决定性的起始和调控作用。但关于亲源因子在胚层形成和分化中的功能研究，受技术限制，一直是早期胚胎发育研究中的难点。本项目选用脊椎动物胚层形成研究中最常用的斑马鱼和爪蛙为模式生物，辅以体外研究系统，利用分子、细胞、生化、组学等多种研究手段，希望能揭示亲源因子在脊椎动物早期胚胎发育，特别是胚层诱导和分化中的功能和分子机制。因此本项目完全能够产生创新性的研究成果。本项目的特色之一是分别从鉴定参与胚层发育的新基因和从胚层形成相关细胞信号和细胞全能性因子入手，以鉴定新基因和新功能为切入点，在很大程度上保证了研究的原创性和新颖性，使整个研究从一开始就站在了本领域的最前沿。本项目的特色之二是选择了合适的研究系统，即斑马鱼、爪蛙和体外细胞系统。斑马鱼和爪蛙均具有产卵量大、体外受精、胚胎体外发育的特性，容易观察胚胎早期的发育过程，也为未受精卵（卵母细胞）和受精卵中的基因修饰（如mRNA的过量表达或抑制）提供了基本条件，因而已成为研究脊椎动物早期胚胎发育的两个最常用的模式系统。此外，斑马鱼上容易进行转基因、诱变等遗传操作以及细胞谱系标记和跟踪；爪蛙胚体大，较容易进行显微手术操作；爪蛙的卵母细胞可以较长时间体外培养，使剔除母源蛋白和抑制母源RNA表达成为可能。体外哺乳动物细胞系在研究细胞信号转导机理方面具有不可替代的优势，可用于阐明基因/蛋白发挥作用的分子机理和网络。本项目将这三个研究系统结合起来，可以充分利用其各自的优势，实现优势互补；又可以在不同系统中互相印证，为实验结果和结论的可靠性提供保证。本项目的特色之三是，在人员组成上，既各有专攻，有互为补充。本项目是在原重大研究计划项目“胚胎早期发育的分子机理研究”基础上的延续，在该项目的资助下，孟安明，陈晔光，张建和吴畏实验室已经建立起紧密的合作关系和通畅的共享技术平台。得益于近两年回国的陶庆华教授和曹萤教授的加盟，给这个团队引入了爪蛙母源基因功能分析技术和干细胞全能性因子在爪蛙中的功能研究体系，加上原有的多年从事早期胚胎发育研究的高水平发育生物学家和长期从事细胞信号转导研究的高水平细胞生物学家，使得这个团队可以全方位地开展胚层形成研究。这几个方面的研究人员的协作将有助于从分子机理上揭示胚层形成的规律，更有可能取得重大的发现。此外，本项目的所有人员都全时在国内工作，主要骨干都有独立的实验室，这样一个稳定的高水平的研究团队，为实现项目的预期目标提供了充分的保障。4取得重大突破的可行性分析研究早期胚胎发育中母源因子对胚层诱导和分化的调控机理是国际上发育生物学的研究热点，但也是难点；而父源RNA在胚胎早期发育中的作用是最近才认识（推测）到的，但尚缺乏实验证据，因而是可产生突破性发现的研究方向。近几年来，本项目的主要参加人员在胚胎发育的调控机理方面做了大量、扎实的工作，获得了一批有重要科学价值的成果。在此基础上，我们计划把研究进一步集中在“亲源因子对胚层形成的调控”这个方向上，取得重大突破性成果的可能性是很高的。工作基础方面，孟安明，陈晔光，张建、吴畏、赵庆顺实验室完全立足国内，已经发现多个参与脊椎动物早期胚胎发育调控的新基因，并详细阐述了它们调控胚胎发育的分子机制和它们与Wnt、TGF-beta等信号的关系，在世界主流杂志Cell、Science、Dev Cell、Development、EMBO J、Blood，Genome Res，PNAS，J Neurosci，J Cell Sci、J Biol Chem、Dev Biol等发表多篇研究论文，并有许多合作发表的高水平论文。陶庆华和曹萤也已经在国内建立了独立的实验室，全时在国内工作，已完成了很有希望的基础性工作（见工作基础），并与参与本项目的其它实验室开始了合作研究。本项目将这几个研究组结合起来，集中精力，从不同角度共同研究早期胚胎发育中胚层形成的调控机理，可以实现不同研究系统的互补和研究结果的相互验证，促进各实验室研究深度的提高，大大提高了取得重大突破的可能性。这样实质性的合作研究是单个研究体系、单个实验室所难以企及的。5. 课题设置（一）课题设置的思路为了实现预定研究目标，我们将围绕“胚层的形成和分化受母源信号控制”这一中心假说，综合利用多学科技术、多模式系统的优势，充分发挥各研究组的学术专长，从多角度、多层面、多视野研究胚层决定和分化过程中生物大分子之间、基本细胞信号通路之间如何相互作用，如何控制胚胎细胞的基本功能，研究早期胚胎如何通过这些分子、细胞水平的调控机制推动个体发育的正常进行。基于这样的思路，同时考虑项目团队成员的研究方向的共性和课题内学术交流的方便性，我们设置四个课题。（二）课题设置课题一、脊椎动物亲源因子的鉴定及功能研究本课题将从两方面开展研究：1. 斑马鱼母源分子在胚层诱导和分化中的作用 （1）关键科学问题 脊椎动物细胞的卵子和精子均包含单倍的染色体，在精、卵融合后启动生物个体的发育过程。卵子不但比精细胞个体大，传统观点认为卵细胞也储存了用于最早期发育的除精子染色体之外的所有必需因子。本课题要探讨的关键科学问题是哪些母源因子在胚层诱导和分化中发挥了关键作用，它们的作用机理是什么，它们与已知的关键发育信号通路的关系是什么。（2）研究目标鉴定新的斑马鱼母源分子，研究它们在斑马鱼卵母细胞周期、胚胎卵裂、胚层决定和分化中的功能，在生化水平探讨它们的作用机制，并研究这些基因与已知胚胎发育中关键信号通路的相互作用关系。将新发现的参与早期发育其他方面调控的基因提供给其他三个课题组进行研究。（3）研究内容母源基因突变体的鉴定：在遗传筛选方面，利用我们已有的Tol2转座子基因插入突变的技术，筛选斑马鱼母源突变体并鉴定和克隆一批斑马鱼母源基因，然后通过转基因GFP示踪、原位杂交、RT-PCR等验证其母源表达的时空特异性，为功能研究提供重要线索。基于表达谱克隆新的母源基因： 通过亚细胞分离等技术从斑马鱼（或者爪蛙）卵母细胞中提取RNA，通过差别表达及深度测序等方法发现新的母源RNA，并克隆进化上保守的母源基因（如：爪蛙、小鼠等）。母源因子功能的研究：在Tol2转座子纯合突变体（GFP插入）中，选择具有早期形态发育异常的突变体，通过PCR手段克隆相对应的基因。合成吗啉环修饰的反义寡核苷酸注射受精卵，通过胚胎期形态观察和分子标记等的检测，确定这些母源基因对形态发生等的影响是否与相对应的纯合突变体一致。类似的吗啉环修饰的反义寡核苷酸也可用于基于表达谱发现的母源基因的功能分析，进一步确定这些母源基因与早期发育相关信号通路的可能相关作用。此外，我们也将建立新的功能缺失分析的新技术，例如：在卵母细胞中敲低母源基因的技术。我们将选择重要的母源基因深入研究其在早期发育中的分子机理：在斑马鱼中利用生物化学、细胞生物学方法研究它们与Wnt、TGF-beta等信号通路的遗传互作。对于进化中保守的母源基因，我们将采用小鼠条件基因敲除的方法，研究它们在哺乳动物中的功能。 2. 父源RNA的鉴定和功能研究（1）关键科学问题单倍体的精子和单倍体卵子受精产生的受精卵（合子）开始生命的发育过程。传统的观点认为，精子对下一代（受精卵）的主要贡献仅限于提供父源的DNA。然而近年的研究表明，在受精过程中，精子释放了数以百计的各种mRNA和小RNA进入卵子，它们对合子胚胎的发育究竟起什么作用、如何起作用，目前几乎是一无所知。这就是本项研究期望解答的科学问题。（2）研究目标鉴定由斑马鱼精子提供给卵子的RNA，研究它们对斑马鱼胚胎卵裂、胚层形成和分化等的影响及其分子机理，探讨它们与已知在胚胎发育中起关键作用的Wnt和TGF-beta等信号通路的关系。（3）研究内容父源RNA的鉴定：从斑马鱼精子和未受精卵中提取RNA，通过深度测序确定存在的mRNA和小RNA，找出特异性的父源（精源）mRNA和小RNA，再通过RT-PCR等方法验证其特异性。父源RNA的保守性的确定：通过生物学信息学方法比较来自斑马鱼、猪、人等物种的精子小RNA和mRNA所编码的蛋白，找出保守的父源mRNA和小RNA。功能性父源RNA的鉴定：针对保守性父源RNA，合成吗啉环修饰的反义寡核苷酸注射受精卵，通过胚胎期形态观察和少量分子标的检测初步确定哪些父源基因和小RNA具有功能。有重要功能的父源基因对胚胎发育的作用：从初步确定有功能的父源基因和小RNA中挑选部分对胚胎发育有明显影响者，在受精卵中注射反义寡核苷酸或mRNA，检测相关发育途径所涉及的基因的表达和蛋白水平的变化，确认其在胚胎发育中的功能和可能涉及的信号通路。重要父源基因的发育功能的分子机理研究：已知Wnt、Nodal、BMP、FGF等信号通路在胚胎的早期发育中起重要作用，将通过生物化学、细胞生物学、遗传学等方法研究有重要功能的父源基因对这些信号通路的可能影响及其在发育中的遗传互作。重要父源基因发育保守性的研究：挑选在斑马鱼上发现的几个有重要功能的父源基因，在爪蛙上检验其功能的保守性。承担单位：清华大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所课题负责人：孟安明，男，47岁，教授，中科院院士，清华大学生命学院学术骨干：张建，男，43岁，研究员，中科院遗传发育研究所经费比例：28.33%课题二：母源因子在胚层诱导和分化中的作用1、关键科学问题非洲爪蛙是研究母源基因在诱导胚层诱导和分化中的功能的最佳模式动物之一。近二十年的分子发育生物学研究表明，母源转录因子VegT在囊胚中期通过激活Sox17， Mixer，GATA4/5/6等转录因子直接启动植物极细胞的内胚层分化命运，同时激活内胚层细胞表达并分泌TGF-beta家族Nodal类生长因子，诱导赤道边缘带细胞发育成中胚层。而外胚层则在囊胚期动物极区域形成，并在原肠运动中受BMP信号和组织者诱导信号的调控分化成表皮以及神经系统。囊胚期外胚层是如何被决定的？是否存在决定外胚层命运的母源位置信息？后生动物胚胎早期发育中普遍存在由母源向合子控制的转换。斑马鱼、非洲爪蛙以及果蝇胚胎发育中的这种转换发生在囊胚中期，因此又称为囊胚中期转换。合子基因组的转录活性如何在囊胚中期被激活？这些问题至今尚无定论。2、研究目标该课题计划以非洲爪蛙为主要模式动物，综合运用正/反向遗传学、生物化学、生物信息学和组学等技术，从分析新母源基因在诱导早期三胚层形成和分化的作用入手，实现如下研究目标：、分离和鉴定诱导外胚层生成的母源因子；、分析母源外胚层诱导因子如何启动外胚层的分化程序；、分析母源外胚层诱导因子与VegT、Nodal、FGF等胚层诱导信号通路间如何相互作用，决定三个早期胚层之间的组织界限形成；、揭示母源因子控制合子基因组在囊胚中期转录开放的分子机制。3、研究内容1）建立非洲爪蛙早期外胚层分化的合子基因调控程序：我们将通过深度RNA测序（RNA-Seq）确定囊胚中期、原肠胚早期预定外胚层中特异表达的合子基因。对它们的功能进行Gene Ontology分类，运用定量RT-PCR验证它们表达时序、运用整体原位杂交方法确认它们在外胚层中表达的组织特异性。同时对在外胚层中特异表达的转录因子、分泌型蛋白以及关键信号通路的调控蛋白进行功能分析，包括过量表达、异位表达以及吗啉环修饰的反义核苷酸介导的敲低。建立外胚层特异表达合子基因之间的层级调控关系，以及它们对外胚层分化命运的影响。在此基础上，我们将进一步分析外胚层特异表达基因与中胚层（Nodal， FGF）、内胚层（VegT、Nodal）诱导信号之间的调控关系，以及外胚层和中胚层组织界限形成的机制。2）分离和鉴定决定外胚层形成的母源因子：运用计算机辅助全基因组序列分析，决定外胚层特异表达基因在基因组上的分布特征，分析这些外胚层特异表达基因的上游调控序列，寻找控制外胚层特异基因表达的保守调控元件，并运用已知的外胚层特异表达基因（如Foxi1e/ Xema, FoxH3, XFDL156, xLim-5, SRF, Ectodermin 等）的上游调控序列进行验证，寻找位于其中的保守调控元件。构建由这些保守元件驱动的Luciferase和GFP报告基因，分析这些保守元件是否能控制报告基因在外胚层中的特异表达。同时对这些保守元件进行突变和缺失分析，建立相关系列报告基因的转基因胚胎，分析这些保守调控元件的必要性。在此基础上构建外胚层特异的保守启动子/增强子驱动的酵母单杂交报告系统，对Unigene母源cDNA文库进行筛选，分离与这些调控序列结合的母源因子。体外合成这些母源因子的mRNA，设计并合成特异的反义寡核苷酸，分别对它们进行过量表达和敲低功能分析。运用ChIP-on-chip技术，分析这些母源转录因子直接调控的合子靶基因，揭示这些母源因子控制囊胚期外胚层形成的机制。我们的前期研究工作已经获得三个新的母源基因对外胚层的诱导具有调控作用，它们分别属于Tbx、Zinc-finger和bHLHZip家族转录因子。进一步的研究将揭示它们的功能作用机制。3）母源因子在调控囊胚中期合子基因组转录活性转换中的功能：囊胚中期转换存在于多数后生动物早期发育中，期间，合子基因组转录大规模开放，包括受母源位置信息控制的胚层特异基因的区域性表达。与之相伴发生的是母源基因的大规模降解、细胞周期特征的改变和胚胎细胞迁移活性的获得。这些现象是受独立控制还是相互关联，是脊椎动物早期发育研究的重大问题之一。我们在进行母源基因敲低功能分析过程中获得几个候选母源转录因子和组蛋白甲基化修饰酶，它们的缺失显著地降低合子基因组在囊胚期的转录活性，并对细胞周期行为有一定影响。我们计划综合运用转录组和蛋白质化学研究手段，对这些母源基因在囊胚中期转换中的功能作深入分析，检验以下三种假说：其一，大量储备的母源转录抑制因子或者表观遗传修饰因子抑制合子基因组的过早开放；其二，母源RNA Pol II转录复合物组分的表达量过低或者不能有效装配；其三，快速的细胞分裂不利于转录的起始或者/和延伸。承担单位：清华大学，中国科学院动物研究所课题负责人：陶庆华，男，39岁，教授，清华大学生命科学院主要学术骨干：赵亚辉，男，35岁，副研究员，中科院动物研究所 经费比例：18.67%课题三：发育关键信号通路的新介导因子对胚层诱导和分化的调控作用1、关键科学问题 Wnt和TGF-beta是两条重要的信号通路，在胚胎发育和成体组织动态平衡维持中起着关键的调控作用。其精确调控的丧失在发育阶段会导致胚胎发育异常，在成体中会导致癌症，如结肠癌、乳腺癌，以及其他疾病的发生。在早期胚胎中，Wnt信号通路参与了胚层背腹轴向分化调控、细胞极性建立和胚胎原肠运动等多个发育过程。TGF-beta超家族成员在胚胎早期发育过程中也参与胚层的诱导形成以及体轴的确定等过程。并且，Wnt和TGF-beta信号通路在不同的层面有着广泛的cross-talk，往往协同调控胚胎发育事件。例如，Wnt信号通路中的Axin能通过Arkadia促进Smad7的降解，从而上调TGF-beta信号；Smad4和Wnt通路中的beta-catenin以及LEF1的相互作用在Spemanns organizer的形成中起着重要的作用; Smad4和Wnt信号调控分子APC的突变在结肠癌发生中都有作用；Smad7和beta-catenin以及LEF1/TCF4之间的相互作用对于TGF-beta诱导的细胞凋亡起着重要的作用；Wnt通路中的Dvl1和Axin都与TGF-beta信号分子Smad3有相互作用。本课题的关键科学问题是在胚胎发育，特别是胚层诱导形成和分化过程中，TGF-beta与Wnt信号是如何发挥作用的。我们将主要利用爪蛙胚胎和小鼠/人胚胎干细胞，研究Wnt和TGF-beta信号的新的调控因子和调控机制，同时，特别关注这两条信号通路在胚层诱导形成和分化调控中的协同作用。2、研究目标该课题计划以爪蛙和胚胎干细胞为研究体系，必要时也会利用斑马鱼和小鼠研究系统，结合细胞培养、分子、生化等研究技术，从鉴定新的TGF-beta以及Wnt信号的调控因子和靶基因入手，探索这两条信号通路在胚层形成以及分化调控中的机制，实现如下研究目标：、鉴定TGF-beta信号的新的调控因子和调控机制，分析他们在胚层形成和分化中的功能；、鉴定Wnt信号的新的调控因子和调控机制，分析他们在胚层形成和分化中的功能；、鉴定受TGF-beta和/或Wnt信号调控的直接靶基因，分析这些靶基因在胚层形成以及分化中的功能；分析TGF-beta和Wnt信号在胚层形成和分化中的协调和交互作用。另外，我们还将同其他三个课题合作，利用他们发现的新基因等共同杨本项目的核心科学问题。3、研究内容：为了发现新的、有重要功能的调控基因，在整体上理解胚胎发育中胚层形成和分化调控的内在机理，我们将主要进行以下几方面的研究。1）新的调控TGF-beta与Wnt通路的分子机制：经过近2030年的研究，TGF-beta和Wnt通路的主要成员大都被发现，已经建立起了信号转导和调控的框架。但是，新的试验方法和技术的出现，让我们有了新的工具来研究他们的调控。我们将利用RNAi文库，从基因组水平来筛选TGF-beta和Wnt通路的调控分子。TGF-beta的受体TGFbetaR1和TGFbetaR2，Smad蛋白是TGF-beta通路中的主要成员，各种各样的翻译后修饰是调控他们功能的重要方式，其中研究最多的是磷酸化和去磷酸化。我们克隆了人类基因组所有被注释的激酶和去磷酸化酶，利用这些资源我们将研究磷酸化和去磷酸化对TGF-beta和Wnt信号通路的调控。组学水平的研究，能让我们更全面的了解TGF-beta和Wnt信号通路的调控。2）TGF-beta与Wnt信号相关因子在早期胚胎发育中的作用和分子机制：TGF-beta信号，特别是其中的Nodal信号在胚胎发育过程中起了重要作用，很多信号通路中的关键分子，比如受体和Smads，在胚胎发育过程中的功能研究已经取得了重要成果。近些年的研究表明，还有很多参与TGF-beta信号调控的分子没有被发现。我们在前期研究中发现了多个TGF-beta/Nodal信号的介导因子（如斑马鱼Smad3a、Smad3b）或调控因子（如Dapper2、BAMBI）相互作用的因子。还发现了一些在缺失Nodal信号的斑马鱼突变体中表达下降的基因，这些因子/基因在胚胎发育中的功能或对TGF-beta信号通路的调控作用并不清楚。我们将研究这些因子/基因在斑马鱼和爪蛙胚胎早期发育中的功能，并利用体外系统阐明它们在TGF-beta信号通路中的作用及其机理。同样，多个Wnt信号的调控因子已被发现在胚胎早期发育中起到关键性的调控作用，但其受体激活机制等关键调控步骤仍很不清楚。而且人们对Wnt信号在上述每一个发育过程中到底如何调控细胞分化几乎一无所知。针对这一问题，目前我们已经鉴定到多个调控Wnt信号的爪蛙基因，都可能以新的调控机制参与Wnt信号转导和调控。接下来我们将深入研究这几个基因的调控机制和生理功能。3）探讨TGF-beta与Wnt通路之间的交互作用和整合如何影响早期胚胎发育：信号通路除了能各自调节自身下游靶基因以外，还能相互协调整合、共同参与对某些下游靶基因的调节。我们将鉴定同时受TGF-beta与Wnt信号调控的下游基因。针对这一问题，我们将借助ChIP-on-chip、Chip-seq等技术，寻找斑马鱼和爪蛙早期发育中的TGF-beta和Wnt通路中的靶基因。我们已经建立了干细胞的研究平台，TGF-beta和Wnt通路在干细胞的自我更新和复制中起着重要的作用，我们也将在小鼠胚胎干细胞中鉴定TGF-beta和Wnt的靶基因。新的靶基因的发现能让我们更好地了解TGF-beta和Wnt通路的功能。此外，我们在过去的研究中已经发现了一些因子对TGF-beta与Wnt通路有复杂的调控作用，例如BAMBI蛋白既能参与上调Wnt通路同时又是一个重要的TGF-beta通路的抑制因子。对于这类的蛋白因子，研究它在早期胚胎发育的不同时期发挥的功能，将是我们今后工作的另一个重点。我们还将着手建立一套基于TGF-beta与Wnt通路报告基因的双荧光筛选系统，以期发现更多的类似BAMBI这样同时作用于两条通路的调控因子。此外，近年发现胰岛素样（IGF）信号通路对胚层的分化也有影响，我们将探讨一些IGF结合蛋白（IGFBP）对胚层分化的影响及其与TGF-beta和Wnt信号通路之间的互作关系。承担单位：清华大学，中国海洋大学课题负责人：吴畏，男，41岁，教授，清华大学生命科学院主要学术骨干：陈晔光，男，45岁，教授，清华大学生命科学院 李筠，女，42岁，教授，中国海洋大学医药学院经费比例：29.67%课题四：多能性因子在胚层诱导和分化中的作用1、关键科学问题：多能性因子，主要包括Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、nanog等转录因子，不仅具有维持哺乳动物胚胎干细胞的未分化状态和自我更新的能力，而且能够将分化的成体细胞诱导成为多能性的干细胞。另一方面，RA信号可以将胚胎干细胞诱导分化成源自不同胚层的细胞。尽管这些多能性因子或信号在再生医学研究领域得到广泛的应用，然而，目前对它们在决定干细胞的命运中如何发挥作用的机制的了解还十分有限。它们作为转录因子是如何拮抗多种促分化信号？如何与表观遗传控制机制协同维持胚胎干细胞的分化潜能？这些多能性因子、RA信号中的不同信号传递因子在多种脊椎动物的卵母细胞和未分化胚胎细胞中都有高表达，为我们探索这些多能性因子在正常发育过程中调控早期胚胎细胞的分化命运的机理提供了理想的研究模型。2、研究目标：综合运用非洲爪蛙、斑马鱼、胚胎干细胞的模型系统研究多能性因子，主要是Oct4和Klf4同源因子在胚层分化中的功能、它们对胚层分化的遗传和表观遗传调节。揭示多能性因子与促胚层分化信号（主要是TGF-beta、Wnt、RA信号通路）之间的相互调节关系；从多层面较为透彻地了解多能性因子如何经由塑造染色质的转录感受性来决定早期胚胎细胞的分化状态。3、研究内容：1）Klf4家族多能性因子在胚层分化中的功能和作用机制：Klf4、Klf2、Klf5同属Kruppel-like factor家族转录因子，它们在胚胎干细胞中都有表达，但是它们在脊椎动物胚胎早期发育中的确切功能还未见报到。因此，我们将运用非洲爪蛙早期胚胎模型，深入分析、比较三者在胚层分化过程中功能的异同。我们已经利用定量RT-PCR和整体原位杂交的方法完成检测Klf4、Klf2、Klf5的时空表达。已经获得这些基因的过量表达载体和特异的吗啉反义寡核苷酸用于敲低实验，分析Klf2、Klf4或Klf5对胚层分化的影响。并将通过交叉拯救实验，区分三者在胚层分化中的功能异同。运用荧光素酶报告基因、蛋白质-DNA结合实验、蛋白质免疫共沉淀等手段，揭示不同Klf因子产生相似或不同功能的原因。与此同时，我们还将通过报告基因、EMSA、Co-IP/GST-pulldown、染色质免疫共沉淀等离体（in vitro）、在体（in vivo）的蛋白-DNA结合等实验，分析Klf家族转录因子对母源VegT、beta-catenin以及合子Nodal信号通路活性的调控，揭示Klf家族转录因子与已知促胚层分化信号通路间的相互作用机制。在斑马鱼系统中检验Klf家族多能性因子的发育功能和机理的进化保守性。2）Klf4和Oct4同源因子Oct25之间的协同作用对胚层分化的影响：我们在前期实验中已经观察到Klf4和Oct25在胚层分化过程中具有协同作用，将进一步利用基因表达芯片，在单独过量表达或者敲低Klf4和Oct25的实验条件下，鉴别受Klf4与Oct25共同调节的靶基因。再用离体（EMSA）或在体（ChIP）验证Klf4和Oct25可以同时结合这些共同靶基因的调控序列。运用荧光素酶报告基因的手段验证两个蛋白对目的基因的调节效应。并在干细胞中对Klf4和Oct25 之间的相互作用机制的保守行作进一步研究。3）Klf4、Oct4等多能性转录因子与组蛋白修饰相关的表观遗传控制因子之间的相互作用。综合运用过量表达、基因敲低、定量RT-PCR、Western Blotting、Co-IP/GST-Pulldown、EMSA、ChIP、报告基因分析等实验手段，检测在胚层分化过程中，Klf4和Oct4同组蛋白表观遗传控制因子之间可能存在的三种作用方式：其一，Klf4和Oct4是否控制表观遗传修饰因子编码基因的表达；其二，组蛋白修饰酶是否对Klf4、Oct4等多能性因子基因的转录具有调控作用；其三，Klf4、Oct4与组蛋白修饰酶是否在共同的靶基因启动子区域协同作用。4）确立母源性RA在胚层分化中的功能和机制。在斑马鱼中利用吗啉反义寡核苷酸敲降或mRNA过表达的方法检测RA、RA代谢酶（包括RA降解酶Cyp26和合成酶Aldh1a）以及RA信号通路中辅阻遏因子（N-CoR和SMRT）在胚层分化中的功能。通过研究母源性的辅阻遏因子（N-CoR和SMRT）在无RA的区域对染色体重塑的影响，确立RA信号通路母源性信息是否通过控制表观遗传的改变而决定胚层的形成和分化。在爪蛙中验证相关因子功能的进化保守性。5）揭示母源性RA信号是否通过调控早期多能性因子或其它早期信号如Wnt、TGF-beta影响胚层的形成和分化。通过改变受精卵内RA信号，研究早期多能性因子或其它早期信号如Wnt、TGF-beta等的表达是否受RA信号的调控。结合生物信息学和体外转录分析，确立这些调控作用的分子生物学机制。承担单位：南京大学，复旦大学课题负责人：曹萤，男，43岁，教授，南京大学模式动物研究所主要学术骨干：赵庆顺，男，45岁，教授，南京大学模式动物研究所 姚纪花，女，44岁，副教授，复旦大学遗传所经费比例：23.33%（三）课题之间的联系本项目的四个课题各有侧重，如课题1和课题2的研究侧重于研究母源和父源分子对胚胎发育的调控作用，课题1以斑马鱼系统为主，课题2以爪蛙系统为主；课题3以Wnt和TGF-beta信号转导新的机理研究为主，侧重于哺乳动物细胞系；课题4重点研究干细胞多能性相关的Klf家族因子和RA信号通路因子的发育功能。但是，各课题之间又有密切的联系和合作。例如，课题1和课题2发现的有重要功能的亲源分子以及课题4发现的干细胞多能因子将与课题3合作，研究它们在Wnt、TGF-beta等信号转导中的作用；课题3发现的Wnt、TGF-beta信号的新调节因子或靶基因，可以通过与课题1、2合作研究它们在斑马鱼和爪蛙胚层形成和分化中的作用，与课题3合作研究其在多能性维持中的作用。课题1发现的斑马鱼重要亲源分子可通过与课题2合作，研究其在爪蛙中的发育功能保守性，与课题4合作研究其在干细胞多能性相关信号通路中的潜在作用。课题2发现的爪蛙重要母源因子可通过与课题1合作探讨其在斑马鱼胚胎中的作用。总之，不同课题间的密切合作将有力地促进高水平研究成果的产出。四、年度计划年度计划内容和目标研究内容预期目标第一年1）完善基于Tol2转座子的基因捕获系统，在斑马鱼上大量获得F0群体。2）利用深度测序法，鉴定斑马鱼母源和父源特异性表达基因；研究爪蛙囊胚期和原肠早期外胚层转录组特点。3）研究前期工作鉴定的多个母源因子（如Tbx、Zinc-finger、bHLHZip、Trithorax、PcG、BTB-POZ、Norrin、Klf4、Klf2、Klf5、aldh1a2和cyp26a1等）等在斑马鱼或爪蛙早期胚胎发育中的作用，尤其是在中囊胚转换、胚层诱导和分化中的作用。4）通过大量表达、RNA干扰、蛋白组学、Chip-chip等技术筛选TGF-beta、Wnt、IGF等信号通路相关因子。5）对卵母细胞及终末分化红细胞核基因组转录抑制物质作初步分析。 1）构建三种新型的Tol2基因捕获载体；建立不少于10000条鱼的转座子基因捕获F0群体。2）鉴定出一批母源、父源特异性和胚层特异性表达基因。3）阐明10个作用母源因子的发育功能。4）鉴定出TGF-beta、Wnt、IGF信号相关的多个新调控因子，初步揭示新分子与相关信号通路的调控关系和在细胞中的大致作用机理。5）初步明确卵母细胞中基因组转录抑制物质是以蛋白质还是RNA发挥作用。6）发表SCI论文6-10篇。7）培养毕业博士生8-12名第二年1）在斑马鱼上基于F0基因捕获群体筛选F1个体和建立F2群体；对F2群体进行突变表型筛选，并进行插入点的基因克隆。2）在斑马鱼和爪蛙上对鉴定的新的母源和父源因子进行大规模的功能分析。 3）探讨分析母源因子及Klf因子、RA信号通路辅阻遏因子N-CoR、SMRT等在三个胚层形成和分化中的交互调控关系及其与TGF-beta和Wnt信号通路间的相互作用机制；探讨组蛋白H3甲基化在外胚层命运决定过程中的调控机制。 4）对非洲爪蛙终末分化红细胞cDNA文库进行过量表达功能筛选；5）继续筛选受TGF-beta、Wnt以及IGF信号调控的直接靶基因；对鉴定到的影响TGF-beta、Wnt以及IGF信号的调控因子，开始进行基因功能研究，分析它们调控信号的机制，分析它们在胚胎发育中的表达模式，通过基因过量表达和功能缺失，探索它们可能的功能。6）利用非洲爪蛙基因表达芯片鉴定Klf4和Oct25协同调节的基因。1） 获得510个斑马鱼母源基因插入突变体， 克隆其中5个突变基因，初步了解其在早期发育中的功能。2）在斑马鱼上初步了解母源去甲基化酶、蛋白酶抑制因子等对中囊胚转换、胚层诱导和分化的作用；并初步确认3-5个有发育功能的父源特异性基因。3）在斑马鱼和爪蛙上阐明几个母源因子在调控胚层决定和分化的作用，初步揭示它们的作用机制；阐明Klf因子调节爪蛙胚层形成的分子机制。 4）获得非洲爪蛙终末分化红细胞核因子中全基因组转录抑制物质的基因身份，初步揭示期作用机理，确定其在囊胚中期转换中的作用。5）初步阐明部分TGF-beta、Wnt和IGF通路相关因子在信号转导中的作用；揭示其在爪蛙、斑马鱼早期胚胎发育中的表达调控机制。6）鉴别出受Klf4和Oct25共同调节的、与胚层分化状态相关的基因。7）发表SCI论文10-15篇。8）培养毕业博士生10-13名。第三年1）继续增加F1插入斑马鱼个体以及F2家系，增加F3突变体的筛选数目；克隆突变体中的突变基因，研究其作用的分子机理。2）继续深入研究母源和父源因子调控中囊胚转换、胚层诱导和分化的分子机制。3）深入研究终末分化红细胞转录抑制物质在卵母细胞和早期胚胎中调控报告基因转录活性的分子机制。4）继续深入研究RA信号通路组份和鉴定的TGF-beta、Wnt和IGF信号通路调控因子和靶基因在信号转导中的作用及其在早期胚胎发育中的作用及机理。5）鉴定重要母源因子和父源因子的互作因子。6）研究Klf4和Oct25调控的基因在胚胎发育中的作用；检测Klf4及Oct4同源蛋白（Oct25、Oct60、Oct91）对表观遗传修饰因子基因的转录调节，初步研究Klf4或Oct4同源因子与组蛋白修饰酶之间的互作关系。7）用GST-pulldown鉴定与Klf4或Oct4同源蛋白相结合的组蛋白甲基化和乙酰化修饰蛋白。1） 获得510个斑马鱼母源基因插入突变体， 克隆其中5个突变基因；阐明3-5个母源突变体的分子机理。2）阐明5-10个母源和父源因子的发育功能和机理。3）深入了解爪蛙外胚层命运决定的遗传和表观遗传控制机制、终末成熟卵母细胞中外源报告基因转录活性控制机制、母源转录因子控制合子基因转录的分子机制。4）进一步明确鉴定的TGF-beta、Wnt和IGF信号通路调控因子和靶基因在信号转导中的作用及其分子机制；阐明部分因子在爪蛙、斑马鱼胚胎发育或干细胞分化中的功能。5）初步阐明在Klf4和Oct25的协同调节作用下对胚层形成的调节机制及其同源蛋白的功能和表观遗传修饰。6）初步确立RA信号通路与Wnt、TGF-beta信号通路之间在胚层分化形成过程中存在相互调节关系。7）发表SCI论文1318篇。8）培养毕业博士生10-13名。第四年1）继续筛选斑马鱼的母源基因突变体和阐明其功能。2）继续研究几个斑马鱼和爪蛙的母源和父源因子基因的详细功能及其与Wnt和TGF-beta信号的相互调控关系。3）研究Wnt和TGF-beta共同调控的靶基因对胚胎发育以及干细胞维持及分化的作用。4）研究Klf4及Oct4同源蛋白如何通过改变组蛋白的修饰状态而影响促分化和抑制分化的基因的表达。5）详尽研究组蛋白修饰酶对Klf4及Oct4同源基因的调控作用；在细胞或胚胎内验证Klf4或Oct4与鉴别出的组蛋白修饰酶之间的相互结合。6）继续研究RA信号通路与Wnt、TGFbeta之间相互调节的分子机制；初步研究RA信号通路组份与多能性因子之间的相互调节关系。7）研究前几年鉴定的重要基因在功能和分子机理上的进化保守性。1）阐明5-8个母源和父源因子的发育功能和机理。2）明确几个重要发育基因与Wnt和TGF-beta信号确定重要母源和父源因子的3-5个互作因子的发育功能。3）揭示鱼类和爪蛙类中囊胚转换的调控机制4）揭示Wnt、TGF-beta、RA信号协同调控靶基因表达的机制和协同调控胚层发育的部分机制。5）确立Klf4和Oct4及其同源蛋白通过调控表观遗传修饰因子基因的转录状态、从而影响到胚层分化的分子机制。6）深入阐明胚胎发育过程中多能性因子与组蛋白修饰酶之间的相互作用关系。7）确认2-3个重要基因的发育功能在