免疫组织化学技术ppt课件

免疫组织化学技术 1 免疫组织 细胞化学IHC ICC 免疫组织化学技术 2 主要内容 免疫组织化学概况免疫组化实验步骤和试剂常见问题及处理方法多色标记 免疫组织化学技术 3 免疫组织 细胞学简介 免疫组织化学技术 4 免疫组织学 是一种把分子水平的物质在组织原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性 定位测定 准确具体表达出来的一种方法 这些分子水平的物质可能与癌细胞 蛋白质 多肽 酶 激素 病原体以及受体等等有关 免疫组织化学技术 5 技术平台 组织切片或细胞爬片纯化的一抗 单克隆或多克隆 标记的二抗 酶 金颗粒或者荧光 显色系统 DAB AEC BCIP NBT FASTRED等 检测系统 普通或荧光显微镜 免疫组织化学技术 6 免疫组织学方法分类 酶免疫组织化学染色 IHC IHC Fr 冰冻切片IHC P 石蜡切片荧光免疫组织染色 IF 多用于冰冻组织切片或者细胞爬片胶体金免疫组织染色 GIHC 免疫组织化学技术 7 根据标本类型分类 石蜡切片 用酶免疫组织染色冰冻切片 多用荧光免疫染色细胞爬片 多用荧光免疫染色 免疫组织化学技术 8 免疫组化相关名称 免疫组织化学技术 9 酶免疫组织化学 IHC 常用方法 PAP APAAP 二抗 HRP AP HRP 抗HRP AP LAB LSAB 二抗 生物素 Biotin HRP 亲和素 S P SAP 二抗 生物素 链酶亲和素 HRP AP ABC SABC 亲和素 链酶亲和素 生物素化HRP AP复合物 非Biotin Avidin方法 Envision两步法 二抗直接偶联酶 免疫组织化学技术 10 S P LAB方法 复合物 链酶亲和素 HRP AP 免疫组织化学技术 11 基本原理 S P LAB方法 一个亲和素和多个标记酶 HRP 结合 多个生物素与抗体 一抗或二抗 结合 细胞的抗原 或一抗 先与生物素化的抗体结合 既而将酶标记的亲和素结合在生物素上 最后进行显色反应定位 免疫组织化学技术 12 ABC方法 ABC复合物 亲和素 生物素化HRP APA 亲和素 B 生物素 C 复合物 免疫组织化学技术 13 基本原理 ABC法 先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合 形成ABC复合物 抗原先后与特异性一抗 生物素化二抗 ABC复合物结合 形成巨大复合物 网络大量酶分子 最后显色 免疫组织化学技术 14 二抗直接偶联酶的Polymer 俗称两步法 免疫组织化学技术 15 基本原理 Envision两步法 抗原与抗体反应结合后 第二抗体上标记有多聚化合物酶复合物 EnVision复合物 与第一抗体结合 进而由酶作用底物进行显色定位 免疫组织化学技术 16 荧光免疫组织染色方法 使用荧光标记抗体 直接定位 定性检测组织或细胞蛋白表达情况 较免疫组化具有灵敏度高 操作简单的优点 缺点是染色组织片不能长期保存 免疫组织化学技术 17 IF常用荧光素 FITC 绿色 激发波长488nm 发射波长515nmRhodamine 橙色 激发波长570nm 发射波长570 590nmTexasRed 红色 激发波长589nm 发射波长570 615nmCy3 橙色 激发波长512 550nm 发射波长570nmCy5 红色 激发波长625 650nm 发射波长670nm 免疫组织化学技术 18 免疫组化实验注意事项 正确选配抗体一抗必须是说明书上经过验证 testedapplication 可以用于IHC IHC P IHC Fr 检测的二抗必须是和一抗来源及亚型相配套的正确设置合适的对照正确选配固定方法和修复方法正确选配显色系统 免疫组织化学技术 19 免疫组化实验对照设置 阳性对照 判断染色全过程和所有试剂的正确性 A 内部对照 对照组织本身明确存在的抗原 二抗系统的正确性 B 外部对照 明确表达待测抗原的组织或细胞 一抗的工作性 阴性对照 明确不表达待测抗原的组织或细胞二抗对照 不加一抗 余操作相同 免疫组织化学技术 20 免疫组化基本操作步骤及需要的试剂 免疫组织化学技术 21 免疫组化基本操作步骤 免疫组织化学技术 22 Envision二步法操作步骤 1 组织切片60 预热2 常规脱蜡入水 二甲苯 各级酒精 水 3 抗原修复4 PBS T洗3次 5min 次5 3 H2O2RT10min 封闭内源HRP 6 PBS T洗3次 5min 次7 10 正常山羊血清RT30min 阻断组织内源IgG Fc R 8 一抗4 孵育过夜9 PBS T洗3次 5min 次10 二抗RT30min11 PBS T洗3次 5min 次12 DAB显色 显微镜下观察 控制显色程度13 充分水洗14 苏木素复染核15 1 盐酸酒精分化16 充分水洗返蓝17 脱水 透明 中性树胶封片 免疫组织化学技术 23 1 载玻片处理 重酪酸钾浓硫酸浸泡24h ddH2O漂洗 95 乙醇浸泡12h防脱粘片剂处理 Poly L Lysine AEPS SpecialReagent可直接购买处理好的载玻片 免疫组织化学技术 24 2 组织固定 如果待测蛋白位于细胞浆或者细胞核内 同时还需要进行破膜处理 标本类型及常用固定液 免疫组织化学技术 25 3 抗原修复 加热修复技术修复方法 微波加热修复 高压热修复 煮沸热修复 常用buffer 柠檬酸Buffer 0 01M pH6 0EDTAbuffer pH9 0非加热修复技术胃蛋白酶 细胞内抗原 0 4 37 30mins胰酶 细胞间抗原 0 05 0 25 37 10 15minsProteinaseK 20ug ml 免疫组织化学技术 26 正常血清 5 10 阻断组织内源IgG Fc RBSA 5 阻断组织内源IgG Fc R特殊封闭试剂 当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织抗原时内源性生物素 亲和素 有些组织如肾脏 肝脏 脾脏含有很高的内源性生物素 如使用SP或者ABC试剂盒需要进行封闭封闭条件 室温30 120mins如是HRP系统 则同时需要使用3 H2O2室温10 30mins淬灭内源性HRP的活性 4 封闭 免疫组织化学技术 27 5 一抗孵育 选择验证过待测种属和实验方法的一抗根据说明书上推荐的固定和修复方法处理标本说明书推荐的稀释比例仅作参考 需要根据标本类型来摸索最佳稀释比例一般是在含1 封闭试剂的缓冲液 比如PBS T TBS T 中4 过夜 免疫组织化学技术 28 6 二抗及酶标记物孵育 根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索最佳稀释比例一般是在含1 封闭试剂的缓冲液 比如PBS T TBS T 中室温 RT 30 60mins也可以选择商业化的试剂盒 SP ABC或者两步法 免疫组织化学技术 29 7 显色 根据所用酶类型选择合适的显色底物 免疫组织化学技术 30 8 复染 免疫组织化学技术 31 9 脱水 透明 封片 免疫组织化学技术 32 10 结果观察 普通光学显微镜荧光显微镜 免疫组织化学技术 33 IHC ICC常见问题分析 免疫组织化学技术 34 常见问题及处理方法 组织脱片非特异性背景染色染色弱无阳性染色 免疫组织化学技术 35 载玻片处理不充分组织固定 脱水 透明不充分组织切片太厚 5um 组织切片有折叠过度的热抗原修复 高压 微波 水煮 抗原修复液的pH值偏高操作过程中冲洗方法不正确 组织脱片常见原因 免疫组织化学技术 36 封闭不充分 增加封闭试剂浓度 延长封闭时间冲洗不充分 短时间多次数的洗涤更有效实验过程中切片干燥 试剂量充足 注意观察 避免干片组织切片折叠组织抗原弥散 组织标本及时固定 选择合适的固定液抗原修复不充分 更改修复方法 优化时间内源性生物素 亲和素 使用封闭试剂或者不用SP ABC系统二抗原因 选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体 设置二抗对照一抗原因 抗体浓度过高 降低抗体浓度 建议4 过夜选择纯化的抗体设置阳性对照试剂污染 重新配置新的缓冲液和试剂 非特异性背景染色 免疫组织化学技术 37 组织固定 包埋时抗原被破坏抗原位于细胞内 未使用破膜剂 尤其是定位于细胞核 抗体浓度过低 孵育时间过短操作中滴加试剂时缓冲液未漓干 致使试剂稀释室内温度 15 过度封闭试剂超过有效期抗体保存不当导致活性降低染色过程中未避光 荧光染色 染色弱常见原因 免疫组织化学技术 38 操作错误 漏加试剂 组织中无抗原固定 包埋 修复时抗原被破坏修复方法不当一抗与二抗不匹配底物和酶不匹配封闭过度封片剂选择不当一种或多种试剂活性降低或失活抗原位于细胞内 未使用破膜剂 无阳性染色常见原因 免疫组织化学技术 39 多标记检测 免疫组织化学技术 40 多标记染色法 适用于同一组织片2 3个不同抗原的检测技术平台 同样的酶 不同底物不同的酶 不同底物荧光检测适用于中性福尔马林固定的石蜡切片 冰冻切片 细胞爬片 免疫组织化学技术 41 多色检测操作程序 第一个抗原检测