荧光定量PCR技术的原理及其应用

荧光定量PCR技术的原理及其应用 基因有限公司技术支持部张会敏 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR real timeQ PCR 技术 指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过参照标准曲线对反应体系中未知模板进行量化分析的方法 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告 使用EB内插染料法插至双链DNA 经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 后来用与双链DNA有更强结合力的染料SYBRGreenI取代EB90年代早期 发现TaqDNA多聚酶具有5 核酸外切酶活性 能在DNA双链聚合过程中降解与模板互补的DNA片段 如特异性探针 因此使得间接的检测PCR产物成为可能 此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程 这些发现以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real timeQ PCR方法在研究工作中的运用 PCR循环 双链DNA 染料 荧光 PCR的理论方程 Y x 1 Ev nY 扩增物数量 X 起始模板数量 Ev 扩增效率 n 扩增循环数 1 终点法定量原理 在最佳实验 循环次数n一定 Ev相同的前提下 根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数 若核酸提取效率相同 与标准品 进而计算出标本中靶分子的准确含量 即 lnX lnY n ln 1 Ev lnY b b为常数 2 实时检测法定量原理 在最佳实验 相同Ev以及相同扩增产物的情况下 反应物中原始分子数 X 与其所需要的扩增循环次数 n 成反比 若核酸提取效率相同 与标准品 进而计算出标本中靶分子的准确含量 即 LgX LgY n Lg 1 Ev b n a a b为常数 传统检测起始模板的定量方法是终点检测法 即PCR快到达平台期进行检测 而不同起始模板浓度经过PCR对数期扩增到达平台期时 最后的差异极小 不仅检测不准确 而且检测重现性很差 同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验 所得结果有很大差异 因此无法直接从终点产物量准确推算出起始模板量 实时荧光定量PCR技术则是根据不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量 克服终点法检测过程中 平台效应 对结果的影响 检测每一轮循环的荧光信号的强度 并记录在电脑软件之中 通过对每个样品Ct值的计算 根据标准曲线即可获得定量的准确结果 实时荧光定量PCR中的三个概念 增长曲线 primarycurve 荧光阈值 threshold CT值 CycleThreshold 增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系 Cycle Fluorescence 域值 PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的偏差的10倍 荧光域值 Threshold 的设定 确定Ct值Ct值 C代表Cycle t代表threshold Ct值的含义是 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 PCR循环在到达Ct值所在的循环数时 刚刚进入真正的指数扩增期 对数期 此时微小误差尚未放大 因此Ct值的重现性极好 即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增 得到的Ct值是恒定的 当循环次数n Ct时 X X0 1 Ex Ct两边取对数 可以推倒出 Ct值与起始模板的关系logN logN0 nlogEn CtCt值与起始模板的关系研究表明 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 其中横坐标代表起始拷贝数的对数 纵坐标代表Ct值 因此 只要获得未知样品的Ct值 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 Interpolationofrealtimegraphicaldatatostandardcurve CT值取决于阈值 阈值取决于基线 基线取决于实验的质量 因此CT值是一个完全客观的参数 CT值越小 模板DNA的起始拷贝数越多 CT值越大 模板DNA的起始拷贝数越少 一般正常的CT值范围在15 35之间 过大和过小都将影响实验数据的精度 通过标准品作出标准曲线 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控 能够实时地观察到产物的增加降低反应的非特异性引物和荧光探针同时与模板特异性结合 提高反应的特异性增加定量的精确性准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便 无需跑胶 荧光定量PCR与普通PCR的比较 荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI LCGreen EvaGreen序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen SYBR GreenI SYBRGreen I 应用范围 起始模板浓度定量溶解曲线分析 可区分单一产物 变异产物 多种产物和引物二聚体基因型分析优点 使用方便 可以应用于不同的模板灵敏 便宜缺点 与非特异性产物结合 通过熔解曲线进行辨别 溶解曲线分析 将温度对荧光强度的变化求导 dI dT 溶解曲线分析 MeltbySybrGreen DNA片断长度特异性 HRM HighResolutionMelt byLcGreen DNA长度特异性碱基特异性 SYBR meltscanreflectproductsize 250bpfragment 500bpfragment Rawdataplot fluorescencevs temp Derivativedataplot dF dTvs temp 500bpfragment 250bpfragment SYBR GreenI是一种PCR抑制剂 使用时浓度不能太高 在熔解过程中有可能重新与还未解链的DNA结合 HRM Saturation Dyes SYBR GreenI LCGreen I LCGreen等染料对PCR抑制作用较小 可以饱和浓度存在 Herrmannetal 2006 Asamodelanalyticaltarget thesicklecellmutationwaschosen Thesicklecellmutationinthe globingeneisanA Ttransversioninthesecondnucleotideofcodon6 A110 bpPCRproductincludingthismutationwithapredictedTmdifferencebetweenhomozygotes AAandTT of0 09 Cprovidesastringenttestfordifferentiation Furthermore theheterozygousATgenotypeprovidesaconvenientsampletoassessthequalityofmutationscanningbymelting Bothhomozygoteresolution AAvsTT andheterozygotescanning AAvsAT werestudiedwitheitherSYBRGreenIorLCGreenPlusasfluorescentindicatorsofDNAmelting Meltcomparison LCGreenIvs SYBRGreenI Derivativemeltingcurveplotsofamolecularsizeladder inset usingeitherSYBRGreenI grayline orLCGreen blackline From High ResolutionGenotypingbyAmpliconMeltingAnalysisUsingLCGreenCarlT Wittwer GudrunH Reed CameronN Gundry JoshuaG Vandersteen andRobertJ Pryor ClinicalChemistry49 6 853 860 2003 HRMworkflowontheRotor Gene6000 AutocallgenotypesUpto100atatime Choosepreferredtube 0 1mLtubes Gene Disc 72 0 2mLtubes Gene Disc 100 RunPCRandHRM HRMProfile HRMontheRotor Gene6000 高灵敏度的光学系统精确的控温方式高精度的温度分辨率 0 02 S 高强度的荧光采集速率 1000次 功能强大的分析软件 Temperature C Fluorescence 82 83 84 85 86 87 88 ExampleSNPgenotypingusingHRManalysis ACTN3 R577X SNPgenotypes C T Tenreplicateseachgenotypeareshown Fragmentpre amplifiedusinga40cyclefastprotocol 40min 突变体筛选SNP分析基因型分析DNA甲基化分析微卫星分析 HRM技术的应用 ConcentrationMeasurement DNAConcentrationMeasurement TheRotor GeneisfullyequippedtodoDNAconcentrationmeasurementusingfluorescentdyesUsingastandardrunprotocolandintegratedanalysissoftware theconcentrationofunknownsamplesisdeterminedfromastandardcurve ADNAstandardcurvewithreplicatesisshown Curveinterpolatedusingasplinecurvefit Rotor Geneanalysissoftware DatawasobtainedusingreagentsintheQuant iT PicoGreen dsDNAKit InvitrogenCorp CarlsbadCA StandardRotor Geneconcentrationanalysisrunprotocolwasused 10 LPicoGreen diluted1 200in1 TEbuffer wascombinedwith10 Lofeachstandard dilutedin1 TEbuffer Finalvolume20 L Concentrationpg L Fluorescence 荧光共振能量传递 FRET 探针法检测PCR反应体系中的荧光 利用的是FRET FluorescenceResonanceEnergyTransfer 原理 当空间距离比较近时 第一个荧光基团受到激发光激发 所发出的荧光会被第二个荧光基团吸收 其结果有两种 第二个荧光基团不发出荧光或者发出另外一种波长的荧光 被检测系统检测到 当两种荧光基团距离比较远时 互不影响 TaqMan 水解型杂交探针 5 端标记有报告基团 Reporter R 如FAM VIC等3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 探针完整 R所发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光 双标记探针 TaqmanProbe 应用范围 起始模板浓度定量基因型分析产物鉴定SNP分析优点 对目标序列有很高的特异性 在SNP应用以及特异性检测 病原微生物的检测 上有独特优势设计简单 准确性好缺点 只适合于一种特异目标的检测 相对价格略高 双标记探针 TaqmanProbe 定量PCR研究方法 绝对定量相对定量基因型分析SNP分析 标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度 logN0 CtlogE logN 绝对定量 未知浓度的样品与标准曲线相比较 绝对定量 标准品 含有目的片段的浓度已知的核酸 如PCR产物 含有目的片段的Plasmid 因PCR产物不稳定 一般采用Plasmid绘制标准曲线时 一般选取4 5个点 多于5个更好 被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度 相对定量 在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化 在基因表达分析研究中 需要比较的是同一基因在不同样本或不同处理中目的基因的表达量 通常是与某一参照品 未处理对照等 的该目的基因进行比较 因此 只需要知道相对于该参照样本目的基因的表达量的变化量 而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少 采用相对定量即可 比较的依据是实验时不同样本或不同处理总核酸模板一致 一般用表达量基本痕定的看家基因作为内参照来体现上样模板的量 再此基础上比较目的基因的表达量 双标准曲线法的相对定量同时作看家基因和目的基因的标准曲线 由看家基因的标准曲线计算出待测样本中所加模板的量 待测样本目的基因的表达量用目的基因标准曲线测得值比上模板量 即可得出不同样本或不同处理下目的基因的表达量差异 比较CT法的相对定量比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量 前提是假设每个循环增加一倍的产物数量 在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量 一个循环 CT 1 的不同相当于起始模板数2倍的差异 但是此方法是以靶基因和内源控制物 即看家基因 的扩增效率基本一致为前提的 效率的偏移将影响实际拷贝数的估计 相对定量方法 相对定量方法一 2 CT方法分析相对基因表达差异 Xn是第n个循环后目标分子数 X0是初始目标分子数 Ex是目标分子扩增效率 n是循环数CT代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数 XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数 CT X是目标分子扩增达到阈值时的循环数 Kx是一个常数 对于目的基因 有公式 到达设定的阈值时 有公式 对于看家基因 也有公式 相对定量时 要比较的是目的基因在总的核酸中所占丰度 看家基因的量即代表了总的核酸量 相对定量方法一 2 CT方法分析相对基因表达差异 用XT除以RT得到 假设目标序列与内参序列扩增效率相同 或 XN代表经过均一化处理过的初始目标分子量 CT表示目标基因和内标基因CT值的差异 CT X CT R 相对定量方法一 2 CT方法分析相对基因表达差异 XN代表经过均一化处理过的初始目标分子量 即目的基因在总核酸中所占比值 CT表示目标基因和内标基因CT值的差异 CT X CT R 最后用任一样本q的XN除以参照因子 calibrator cb 的XN得到 对于一个少于150bp的扩增片断而言 如果Mg2 浓度 引物都进行了适当的优化 扩增效率接近于1 因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是 相对定量方法二 双标准曲线法 由于在相对定量的表达是相对于某个参照物的量而言的 因此相对定量的标准曲线就比较容易制备 对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可 在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线 最终必须除以参照物的量 即参照物是1 的样本 其它的样本为参照物量的n倍 在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量 也需要在反应中同时扩增一内源控制物 如管家基因等 同时作看家基因和目的基因的标准曲线 由看家基因的标准曲线计算出待测样本中所加模板的量 通过待测样本目的基因的表达量用目的基因标准曲线测得值比上模板量 即可进行不同样本或不同处理下目的基因的表达量差异的比较 相对定量方法二 双标准曲线法 当两个扩增反应效率不同或者不方便证明的时候 则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量 或者也可以重新设计引物 优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率 做双标准曲线则只需要制备标准品 标准品梯度稀释 荧光定量实验检测通过看家基因序列的标准曲线检测出模板浓度通过目的基因序列的标准曲线检也能测出一个模板浓度目的基因的浓度比上看家基因的浓度得出该目的基因在该样本中的丰度不同样本之间丰度的比较即可得出基因的相对表达量 研究思路 一对共同的引物 两条探针 探针标记不同的荧光基团 如FAM和VIC 基因型分析 野生型和突变型分析SNP分析 AACCTGCATAATGCCAGAACCTGCAGAATGCCAG 通过探针特异性检测SNP 单点核苷酸多态性 SingleNucleotidePolymorphisms FAM 等位基因II纯合子VIC 等位基因I纯合子FAM VIC 等位基因I II杂合子 PCR后鉴定 基础研究中基因表达丰度的测定差异基因的表达检测 基因型分析临床医疗领域病原体的检测和基因诊断 包括特定基因的检测 寄生虫和细菌等病原体的检测环境监测 包括水质 空气的污染检验检疫工作 食品卫生检验 转基因作物的检验法医的遗传学鉴定新药的开发和研究 荧光定量PCR技术的应用领域 荧光定量PCR实验技术路线 查询目的基因序列设计特异引物 产物片段一般在80 300bp 选择合适的荧光标记方法选染料法 进行多基因研究 则购买SyBrGreenI或相应试剂盒探针法 提高反应特异性或做SNP研究 则设计并合成荧光探针 PF PR Q R 应用实例一 VirologyJournal20052 61 71Simultaneousdetectionofherpessimplexvirus HSV types1and2byreal timePCRandPyrosequencingMartinEA MelanieF JasonTetal 应用实例一 引物上游引物 TTCTGCAGCTCGCACCAC下游引物 GGAGCGCATCAAGACCACC探针HSV1 FAM CGATGGCAACGCGGCCCAACATATCGTTGAC BHQ1HSV2 Cy5 CGATGCGCCCCAGCATGTCGTTCACGT BHQ2标准模板PCR扩增产物亚克隆到pCRII TOPO载体 筛选阳性克隆 提取质粒并用分光光度计测定浓度 梯度稀释制作标准模板 4581份标本 479份阳性 其中133份感染HSV 1 346份感染HSV 2 应用实例二 基因工程 ProcNatlAcadSciUSA 2003Jan7 100 1 364 9GeneticallyengineeredstemrustresistanceinbarleyusingtheRpg1gene 通过农杆菌将Morex 疏穗六棱品种 的Rpg1基因转入容易感染茎锈病的大麦幼胚中 后者获得了对茎锈病的抵抗力 为研究Rpg1基因的表达水平是否与抗性存在比例关系 作者用定量PCR技术对Rpg1mRNA进行定量 ThePlantCell Vol 15 79 92 AlteredCellCycleDistribution Hyperplasia andInhibitedDifferentiationinArabidopsisCausedbytheD TypeCyclinCYCD3 CYCD3 1在拟南芥中的表达与组织增殖 叶片发育等相关 而与已分化的组织无关 研究证明了CYCD3在增殖转为分化过程中有着关键作用 为了弄清其功能 研究了CYCD3 1与细胞周期的关系 并对CYCD3 1过表达情况下植株分化 发育的情况进行了研究 利用定量PCR技术研究了CYCD3 1过表达对其它相关基因在转录水平的影响 运用 Ct相对定量法 应用实例三 基因表达调控 ThePlantCell 2002 14 2481 2494 ExpressionProfileAnalysisoftheLow OxygenResponseinArabidopsisRootCultures 使用microarray技术确定低氧环境中培养的拟兰芥根中的基因 该篇文章将microarray与实时定量技术相结合研究基因的表达变化 应用实例四 基因芯片结果验证 Rotor Gene20002000 Rotor Gene60002006 Rotor Gene30002003 Centr